孟勝喜，霍清萍，王 兵，付劍亮，彭文波，王宇新，梁 芳，汪天湛，張洪艷，余忠海，彭學(xué)豐，李學(xué)敏，曹健美，李文濤

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)屬于一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性病變，其主要臨床表現(xiàn)為記憶衰退和認(rèn)知障礙[1]。AD是癡呆最常見的原因，以其高發(fā)病率、高病死率成為重要的世界公共衛(wèi)生問題，同時也是一種嚴(yán)重威脅到老年人的健康和生活質(zhì)量的疾病[2-3]。隨著全球人口老齡化的加劇，AD病人日益增多，尤其是在65歲以上的老年人群中，發(fā)生率可高達12%。預(yù)計到2050年，AD病人將達到11 500萬人，這將極大增加社會和個人的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[4-5]。中醫(yī)藥具有多系統(tǒng)、多靶點、多層次作用特點，并且毒副作用小，安全性較好，在AD的防治上有自身的特點及優(yōu)勢。恒清Ⅱ號方是本課題組長期用于治療AD 的臨床經(jīng)驗方。本實驗基于尿代謝組學(xué)探討恒清Ⅱ號方治療AD的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 儀器及實驗用品 Agilent1200高效液相色譜儀(美國安捷倫)；micr-OTOF-QⅡ質(zhì)譜儀(德國布魯克)； PoroShell 120EC-C18色譜柱(美國安捷倫)；SAESHIN 90+10(韓國Saeshin)；FIS13-990-16超低溫冰箱(Thermoscientific)；FA1204L電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。甲酸購于CNW公司(中國上海)；甲醇、乙腈、超純水均購于Merck(Darmstadt，Germany)公司；2-氯苯丙氨酸(DL-o-Chlorophenylalanine)購于GL Biochem (上海) Ltd.公司。

1.2 實驗藥物 鹽酸多奈哌齊(安理申)購自衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050978；批號：1705080，規(guī)格：每片5 mg。恒清Ⅱ號方組成：益智仁30 g，黃芪15 g，菟絲子10 g，川芎10 g，熟地黃15 g，桑寄生10 g，煅石決明10 g，杜仲10 g，地龍10 g，天麻10 g，鉤藤10 g。由上海市第六人民醫(yī)院中藥房提供。按處方比例稱取藥材，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮3次，每次40 min，過濾，合并3次濾液，37 ℃水浴加熱濃縮，根據(jù)臨床的實際用藥情況，對藥液進行濃縮處理，并以中質(zhì)量濃度匹配臨床的實際用藥濃度。中質(zhì)量濃度濃縮至0.535 0 g/mL，恒清Ⅱ號方低劑量為0.267 5 g/mL，中劑量為0.535 0 g/mL，高劑量為1.070 0 g/mL，分別置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗動物及分組 取SPF級雄性APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠6月齡50只，隨機分為模型組(model組)、恒清Ⅱ號方低劑量組(HQ-L組)、恒清Ⅱ號方中劑量組(HQ-M組)、恒清Ⅱ號方高劑量組(HQ-H組)、安理申組(Aricept組)，每組10只。6月齡C57BL/6J小鼠10只作為正常組(normal組)。全部動物購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2018-0006，預(yù)飼養(yǎng)2周，分別單籠喂養(yǎng)，光照與黑暗12 h交替1次，溫度(22±2)℃，相對濕度(60±5)%，自由攝食和飲水。

1.4 方法

1.4.1 干預(yù)方法 HQ-L組、HQ-M組、HQ-H組分別給予低劑量、中劑量、高劑量恒清Ⅱ號方灌胃，Aricept組用安理申溶液灌胃，均為每日2次。恒清Ⅱ號方低、中、高劑量及安理申溶液給藥濃度，依據(jù)人和動物體表面積折算系數(shù)換算[6]，計算結(jié)果為14.8 g/kg。normal組、model組給予等體積生理鹽水灌胃，每日2次。各組均持續(xù)灌胃30 d。

1.4.2 認(rèn)知功能測試 干預(yù)結(jié)束后，采用Morris水迷宮進行定位航行實驗和空間探索實驗，檢測各組小鼠的認(rèn)知能力，記錄逃避潛伏期(escape latencies，EL)和120 s內(nèi)小鼠通過虛擬平臺的次數(shù)，即跨越平臺次數(shù)(number of crossing platforms，NCP)，用Morris水迷宮圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)完成對實驗的數(shù)據(jù)采集以及處理。

1.4.3 尿液收集與處理 給藥30 d后，收集尿液，用移液槍吸取100 μL尿液樣本，加入300 μL甲醇和10 μL內(nèi)標(biāo)(2.8 mg/mL，二氯苯丙氨酸)。渦旋30 s混勻；于-20 ℃下靜置1 h；于4 ℃下12 000 r/min離心15 min；吸取200 μL上清液，轉(zhuǎn)入進樣小瓶中待LC-MS檢測分析。

1.4.4 LC- MS分析 儀器分析平臺：LC-MS(Thermo，Ultimate 3000LC，Q Exactive)；色譜柱：C18色譜柱[Hyper gold C18 (100 mm×2.1 mm，1.9 μm)]；色譜分離條件為：柱溫為45 ℃；流速0.35 mL/min；流動相組成A：水+5%乙腈+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；進樣量為10 μL，自動進樣器溫度4 ℃。

1.4.5 質(zhì)譜檢測參數(shù) 正模式：加熱器溫度300 ℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速15 arb，尾氣流速1 arb，電噴霧電壓3.0 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，S-Lens RF Level 30%。負(fù)模式：加熱器溫度300 ℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速15 arb，尾氣流速1 arb，電噴霧電壓3.2 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，S-Lens RF Level 60%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 原始數(shù)據(jù)首先利用Thermo工作站軟件中Xcalibur轉(zhuǎn)化為CDF格式文件，然后在R軟件中利用XCMS包進行峰提取、峰比對和峰過濾，補充缺失峰，數(shù)據(jù)最終標(biāo)準(zhǔn)化為Excel格式的二維數(shù)據(jù)矩陣，包含保留時間(retention time，RT)、質(zhì)荷比(MZ)、觀察量(樣本)和峰強等信息。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 13.0(Umetrics AB，Umea，Sweden)軟件進行多元統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠EL、NCP比較 與normal組比較，model組小鼠EL明顯增加，NCP明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與model組比較，HQ-M組、HQ-H組、Aricept組小鼠EL明顯縮短，穿越平臺次數(shù)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與HQ-L組比較，HQ-M組、HQ-H組、Aricept組小鼠EL明顯縮短，NCP明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與HQ-M組比較，HQ-H組小鼠EL明顯縮短，NCP明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Aricept組比較，HQ-H組小鼠EL明顯縮短，NCP明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。恒清Ⅱ號方低、中、高劑量之間的作用比較：HQ-H組>HQ-M組>HQ-L組，即恒清Ⅱ號方的量效關(guān)系呈正相關(guān)；高劑量恒清Ⅱ號方與安理申之間的作用比較，HQ-H組>Aricept組，即高劑量恒清Ⅱ號方的作用要優(yōu)于安理申。詳見表1。

表1 各組小鼠EL與NCP比較(±s)

2.2 各組小鼠尿液總離子流圖 QC樣本的總離子流色譜圖(TIC)見圖1。觀察發(fā)現(xiàn)儀器的保留時間重現(xiàn)較好，儀器穩(wěn)定，因而提高了儀器分析和數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性。

圖1 QC樣本總離子流色譜圖

2.3 各組小鼠尿液1H-NMR模式識別分析 每組小鼠的積分值采用OPLS-DA方法對兩組間差異化合物進行比較分析，可看出normal組與model組、HQ-L組與model組、HQ-M組與model組、HQ-H組與model組、Aricept組與model組分布的區(qū)域完全分開、無交叉。各組的Q2值依次為0.774、0.812、0.845、0.832、0.766，Q2值均大于0.4，可以認(rèn)為模型預(yù)測結(jié)果良，說明兩組間代謝物均有差異。詳見圖2～圖9。

圖2 model組與normal組尿液1H-NMR模式識別分析

圖3 HQ-L組與model組尿液1H-NMR模式識別分析

圖4 HQ-M組與model組尿液1H-NMR模式識別分析

圖5 HQ-H組與model組尿液1H-NMR模式識別分析

圖6 Aricept組與model組尿液1H-NMR模式識別分析

圖7 HQ-L組與Aricept組尿液1H-NMR模式識別分析

圖8 HQ-M組與Aricept組尿液1H-NMR模式識別分析

圖9 HQ-H組與Aricept組尿液1H-NMR模式識別分析

2.4 潛在生物標(biāo)記物分析

2.4.1 潛在生物標(biāo)記物的選擇 樣品因子載荷顯示有4種產(chǎn)物的載荷圖荷質(zhì)比距離在0.006 以上，且與其余相關(guān)產(chǎn)物相比較，具有顯著優(yōu)勢。故本實驗采用對分類貢獻較大的這4種物質(zhì)作為特征生物標(biāo)記物。

2.4.2 潛在生物標(biāo)記物的鑒別 通過標(biāo)定相應(yīng)編號質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比和保留時間，采用正離子檢索模式即加氫、加水或加乙腈，以誤差5 μg/mL(5 ppm) 以內(nèi)，同位素峰匹配度不低于95%為匹配條件并結(jié)合統(tǒng)計分析方法[7]篩選特征代謝產(chǎn)物。最終鑒別出α-生育三烯酚(α-tocotrienol)、鞘氨醇激酶(sphingsine)、多巴胺(dopamine)及膽固醇(cholesterol)4種潛在生物標(biāo)記物。

2.5 4種標(biāo)記物的含量變化趨勢 將鑒定出的物質(zhì)在各個樣本中的含量進行(峰面積)統(tǒng)計，使用單因素方差分析方法進行分析，若方差不齊使用K-W檢驗，若方差齊則使用 LSD 檢驗。在各組小鼠尿液中潛在標(biāo)志物含量方面，與normal組比較，model組尿液中α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量降低，膽固醇含量均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與model組比較，HQ-M組、HQ-H組、Aricept組α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量均升高，膽固醇含量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與HQ-L組比較，HQ-M組、HQ-H組、Aricept組α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量均升高，膽固醇含量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與HQ-M組比較，HQ-H組α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量均升高，膽固醇含量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Aricept組比較，HQ-H組α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量均升高，膽固醇含量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 4種標(biāo)記物在各組小鼠尿液中的含量(峰面積)比較(±s)

2.6 各組小鼠尿液差異性代謝物相關(guān)代謝通路分析 為研究所有差異性代謝物所涉及的代謝途徑及各代謝物之間的相互作用關(guān)系，參考KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫，利用MetPA分析平臺對最終得到所有差異代謝物進行代謝通路富集分析。在取得差異代謝物的匹配信息后，對對應(yīng)物種的通路數(shù)據(jù)庫進行搜索和代謝通路分析。代謝通路分析見表3。

表3 各組小鼠差異代謝物相關(guān)的代謝通路

3 討 論

AD的臨床表現(xiàn)為進行性記憶減退及認(rèn)知功能減退的神經(jīng)退行性疾病。目前全球大約有3 700萬人受累，預(yù)計每20年翻一倍，已經(jīng)成為一個全球性的健康問題[8]。AD屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”“善忘”等范疇。腎虛痰阻血瘀是本病的病機特點，其中腎虛為本，痰阻、血瘀為標(biāo)，本虛標(biāo)實。恒清Ⅱ號方是本課題組根據(jù)長期臨床經(jīng)驗總結(jié)而來的治療AD的經(jīng)驗方。該方由益智仁、黃芪、菟絲子、川芎、熟地黃、桑寄生、石決明、杜仲、地龍、天麻、鉤藤11味藥物組成，具有補益腎精、化痰祛濁、活血化瘀的功效，使髓海得以充養(yǎng)，神智得以恢復(fù)，從而治療AD。前期經(jīng)過大量臨床驗證，恒清Ⅱ號方治療AD療效確切。

從本實驗結(jié)果可以看出，在改善AD小鼠認(rèn)知功能方面，與model組比較，HQ-M組、HQ-H組、Aricept組小鼠EL明顯縮短，NCP明顯增加(P<0.01)；與HQ-L組比較，HQ-M組、HQ-H組、Aricept組小鼠的EL明顯縮短，NCP明顯增加(P<0.05或P<0.01)；與HQ-M組比較，HQ-H組小鼠的EL明顯縮短，NCP明顯增加(P<0.05)；與Aricept組比較，HQ-H組小鼠EL明顯縮短，NCP明顯增加(P<0.05)。恒清Ⅱ號方低、中、高劑量之間作用比較：HQ-H組>HQ-M組>HQ-L組，即恒清Ⅱ號方的量效關(guān)系呈正相關(guān)；高劑量恒清Ⅱ號方與安理申之間的作用比較，高劑量恒清Ⅱ號方的作用要優(yōu)于安理申。

在AD小鼠尿液中潛在標(biāo)記物方面，本研究結(jié)果表明，APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠尿液中潛在生物標(biāo)志物為α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺、膽固醇；AD小鼠尿液中α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量與恒清Ⅱ號方的劑量呈正相關(guān)，AD小鼠尿液中的膽固醇含量與恒清Ⅱ號方的劑量呈負(fù)相關(guān)；高劑量恒清Ⅱ號方各劑量組小鼠尿液中α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量高于安理申組，恒清Ⅱ號方高劑量組小鼠尿液中的膽固醇含量低于安理申組。

生育三烯酚(tocotrienol)可保護神經(jīng)細(xì)胞免受氧化損傷[9]。納摩爾濃度的α-生育三烯酚是唯一可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的特定介質(zhì)而防止誘導(dǎo)的神經(jīng)變性的試劑[10]。生育三烯酚可以消除或淬滅活性氧自由基，阻止脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，有效阻止氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的形成，從而抑制粥樣斑塊的形成[11]。催化1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)生成的酶是鞘氨醇激酶。S1P參與少突膠質(zhì)細(xì)胞[12]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘細(xì)胞[13]的生長和存活，以及調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性[14]。鞘氨醇激酶1的激活和S1P的形成可以保護中腦神經(jīng)元免受谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的影響[15]。多巴胺參與AD的病程，主要與AD病人的精神癥狀有關(guān)。AD病人的尸檢發(fā)現(xiàn)紋狀體、杏仁核、黑質(zhì)、扣帶回、中縫核等部位多巴胺含量降低[16]。在AD病人的腦脊液和尿液中多巴胺含量也有降低，并且與病程有明顯的相關(guān)性[17]。膽固醇水平的增加可調(diào)節(jié)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的APP內(nèi)吞作用，從而導(dǎo)致Aβ42分泌增加，誘導(dǎo)形成類似于AD大腦受影響神經(jīng)元中增大的早期內(nèi)涵體，增大的早期內(nèi)涵體表明膽固醇是AD的潛在治療靶標(biāo)[18]。神經(jīng)元中膽固醇濃度增加可能導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)變性及神經(jīng)元凋亡，從而導(dǎo)致認(rèn)知障礙。淀粉樣蛋白病理學(xué)改變在AD臨床癥狀發(fā)作前至少20年已經(jīng)發(fā)生[19]。

恒清Ⅱ號方抗AD作用的相關(guān)代謝通路方面，通過對生物標(biāo)志物的分析，發(fā)現(xiàn)恒清Ⅱ號方的抗AD作用主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑，?；撬岷蛠喤；撬岽x途徑，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑，半胱氨酸和蛋氨酸代謝及三羧酸循環(huán)，即氨基酸生物合成、氨基酸代謝以及能量代謝等途徑。①纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，是人與動物自身不能合成而必須依賴外源供給的三大必需氨基酸，具有促進蛋白質(zhì)合成、抑制蛋白質(zhì)分解的多種生理功能。②牛磺酸和亞?；撬岽x途徑：牛磺酸具有促進腦發(fā)育，改善學(xué)習(xí)記憶能力，提高神經(jīng)纖維傳導(dǎo)，抗脂質(zhì)過氧化能力，保護神經(jīng)細(xì)胞的作用[20]。?；撬峥梢詼p少錳致大鼠的神經(jīng)細(xì)胞損害，改善空間記憶能力，減少氧化損傷[21]。③甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑：甘氨酸作為腦內(nèi)最為重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)，進而聯(lián)合作用于谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)傳遞，NMDA受體的激活，對于學(xué)習(xí)記憶能力的維持以及長時程增強起著重要的作用[22]。④半胱氨酸和蛋氨酸代謝：高水平同型半胱氨酸可能通過損傷血管內(nèi)皮、激活NMDA受體及磷酸化tau蛋白或抑制蛋白磷酸酶-2A活性，從而引起氧化應(yīng)激、增加細(xì)胞毒性和β淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積等多途徑或環(huán)節(jié)，最終導(dǎo)致癡呆的發(fā)生[23]。④三羧酸循環(huán)作為三大營養(yǎng)素(糖類、脂類、氨基酸) 的最終代謝通路，是機體獲得能量的主要方式。它是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，分布在線粒體內(nèi)。

綜上所述，恒清Ⅱ號方可以改善AD小鼠的認(rèn)知功能，且呈量效關(guān)系；其劑量與AD小鼠尿液潛在生物標(biāo)記物α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量呈正相關(guān)，與膽固醇含量呈負(fù)相關(guān)，其作用與氨基酸的生物合成、氨基酸代謝以及能量代謝等代謝通路有關(guān)。