腺嘌呤核苷三磷酸生物發(fā)光法快速檢測短乳桿菌

郭立蕓,向杰,謝鑫,侍亞敏

1(北京燕京啤酒股份有限公司技術中心，北京，101300)2(啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京，101300)

腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)是高能磷酸化合物，由1分子核糖、1分子腺嘌呤和3個相連的磷酸基團構成的核苷酸，廣泛存在于各種動物、植物和微生物的活體細胞中。當活體細胞裂解或死亡后，在胞內(nèi)酶的作用下，游離的ATP分子數(shù)量會迅速下降或消失[1]。1983年，日本學者MOYER等[2]首次提出細胞內(nèi)源性ATP的含量可以反映細胞活性和活細胞數(shù)量，主要原理是ATP在蟲熒光素酶的催化作用下，與熒光素在有氧環(huán)境及Mg2+作用下反應釋放出熒光，熒光強度與ATP數(shù)量在一定范圍內(nèi)呈線性關系[3]。20世紀80年代，英國人率先研制出ATP熒光檢測系統(tǒng)，隨后發(fā)展到歐洲、美國和日本，應用領域涉及食品加工、超市和飲食行業(yè)，檢測內(nèi)容包括微生物和食品殘渣[4]。2018年我國頒布標準GB/T 36004—2018《食品接觸表面清洗消毒效果實驗方法 三磷酸腺苷生物發(fā)光法》，規(guī)定采用ATP生物發(fā)光方法評價食品接觸面清洗消毒效果，為生產(chǎn)企業(yè)執(zhí)行危害分析與關鍵控制點(hazard analysis and critical control point，HACCP)提供快速有效的技術手段。目前，該方法已在乳品發(fā)酵[5]、面粉生產(chǎn)[6]、啤酒行業(yè)[7]領域引入，應用于食品企業(yè)生產(chǎn)原料、過程控制、設備表面清潔及微生物污染情況的檢驗。

啤酒是一種發(fā)酵飲料，營養(yǎng)豐富，素有“液體面包”之稱，其釀造過程中始終伴隨著微生物污染的風險，機械設備、人員及其裝備表面附著微生物和原位清洗(cleaning in place，CIP)不當均可造成外源微生物的侵入，導致啤酒濁度的增加、香氣和風味的改變。平板計數(shù)法是對細菌總數(shù)進行檢測的國標方法[8]，但該方法檢測周期長，不適合現(xiàn)場實時檢測。因此，為加強對啤酒污染微生物的管理與控制，本研究引入便攜式ATP快速檢測系統(tǒng)分別對人工污染短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)的物體表面、水質和有機質殘留進行檢測，并以此建立預測模型，快速定量評價啤酒釀造過程中關鍵控制點的短乳桿菌及有機質污染情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

短乳桿菌，公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 主要儀器與試劑

MVP ICONTMATP型快速檢測儀，德國默克公司；BX53型普通光學顯微鏡，日本OLYMPUS公司；A49474型手持糖度計，日本愛拓公司；MVP ICON型電導率探針、MVP型ATP表面檢測棒、MVP型ATP水質檢測棒，默克化工技術(上海)有限公司。

NBB-A/B培養(yǎng)基，德國德樂公司；10 °P純生啤酒，包裝車間提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 表面細菌總數(shù)檢測及標準曲線的建立

從試管中挑取短乳桿菌1環(huán)，接入NBB-B培養(yǎng)基進行活化，36 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心5 min收集菌體，無菌水洗滌2～3次。使用無菌水將短乳桿菌懸浮液連續(xù)梯度稀釋，稀釋至可以得到單菌落的濃度梯度為101～103個/mL為止，用傾注平板法向NBB-A培養(yǎng)基注入1 mL稀釋的混合菌液，每個稀釋梯度做2個平行，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)72 h后，對平板上形成的單菌落進行計數(shù)。同時，分別吸取1 mL懸浮菌液均勻涂布于無菌培養(yǎng)皿中，超凈工作臺中靜置至風干，表面檢測棒涂抹采集后，檢測對應梯度菌液相對熒光單位(relative luciferase unit，RLU)值。以RLU為橫坐標、菌落總數(shù)對數(shù)值lg CFU為縱坐標建立表面細菌總數(shù)預測模型。

1.2.2 水質細菌濃度檢測及標準曲線的建立

高速離心法富集短乳桿菌菌體，無菌水洗滌2～3次后使用無菌水進行重懸浮，使用血球計數(shù)板進行顯微計數(shù)。使用無菌水將短乳桿菌懸浮液連續(xù)梯度稀釋至100個/mL，25 ℃靜置48 h后，使用水質檢測棒取樣，檢測對應梯度菌懸液的RLU值。并以RLU為橫坐標、細菌濃度對數(shù)值lg(個/mL)為縱坐標建立預測模型。

1.2.3 啤酒有機質殘留檢測及標準曲線的建立

使用無菌水進行10 °P純生啤酒2倍梯度稀釋，稀釋后的各組樣品用糖度計進行糖度檢測，同時采用ATP快速熒光檢測系統(tǒng)進行各組稀釋樣品的RLU值檢測，做啤酒稀釋倍數(shù)與RLU值變化曲線并建立預測模型。

2 結果與分析

2.1 表面細菌總數(shù)與ATP熒光值的相關性分析

由于ATP生物發(fā)光法無法定性鑒別細菌種類，因此不同細菌ATP含量的差異可能直接影響對菌落總數(shù)的快速檢測。田雨等[9]對比分析了枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸片球菌、乳酸鏈球菌等6種常見細菌中ATP含量的差異性，結果顯示當細菌總數(shù)相同時，ATP生物發(fā)光法檢測的熒光值無明顯差異。因此，本實驗以引起啤酒腐敗最多的短乳桿菌進行表面菌落總數(shù)與ATP熒光值的相關性研究。短乳桿菌菌落總數(shù)控制在100～107CFU，以未污染的潔凈表面為陰性對照，共獲得21組檢測數(shù)據(jù)，檢測結果如表1所示。在該組數(shù)據(jù)中，RLU值最高為5 000，對應的菌落總數(shù)為1.1×107CFU；最低為無菌陰性對照，RLU值為7。當菌落總數(shù)大于2.2×103CFU時，即Zone值位于“預警”區(qū)域范圍，RLU值呈指數(shù)增長趨勢，預示檢測表面存在大量微生物殘留。

表1 表面細菌總數(shù)與RLU值檢測結果Table 1 Detection results of total surface bacteria and RLU value

以lg(菌落總數(shù))為橫坐標、RLU值為縱坐標建立預測模型，如圖1所示。由圖1可知，lg(菌落總數(shù))與RLU值存在正相關，可擬合為指數(shù)增長的數(shù)學預測模型，指數(shù)方程為y=2.103 9e1.120 9x(R2=0.906 4，P<0.05)，擬合效果較好，可對危害分析和關鍵控制點進行表面微生物總數(shù)預測。然而，使用臺式ATP熒光快速檢測儀檢測的ATP熒光值與菌落總數(shù)常擬合為線性相關方程[10-11]，這可能是由于便攜式和臺式ATP熒光檢測儀的檢測靈敏度存在差異，但并不影響本實驗中表面菌落總數(shù)預測模型的建立。

圖1 表面細菌總數(shù)預測模型Fig.1 Prediction model of number of bacteria on the surface

2.2 細菌濃度與ATP熒光值的相關性分析

啤酒生產(chǎn)企業(yè)絕大多數(shù)釀造用水是深井水，能在深井水中生存的微生物一般不耐酸、不耐酒精，因此不能在啤酒中生長，但啤酒在運輸經(jīng)過管道、蓄水池、儲水罐及接觸空氣時就會被微生物污染，會在啤酒釀造過程中產(chǎn)生污染[12]。實驗室無菌水經(jīng)人工污染短乳桿菌后，室溫靜置48 h，短乳桿菌濃度控制在3.5×100～3.5×108個/mL，采用便攜式ATP快速熒光檢測儀進行檢測，共獲得10組數(shù)據(jù)，檢測結果見表2。當短乳桿菌濃度為3.5×108個/mL，RLU值最高為577；當檢測無菌水時，RLU值最低為9。

表2 細菌濃度與RLU值檢測結果Table 2 Detection results of bacterial concentration and RLU value

以lg(細菌濃度)為橫坐標、RLU值為縱坐標建立預測模型，如圖2所示。lg(細菌濃度)和RLU值呈正相關，數(shù)據(jù)可擬合為指數(shù)方程為y=6.250 3e0.507 7x(R2=0.98，P<0.05)，擬合效果較好。當水質檢測RLU值>10時，即可證明水質中有微生物存在，與電化學阻抗法[13]、常規(guī)PCR法[14]和免疫學法[15]等相比，極大地縮短了檢測時間和成本。

2.3 啤酒有機質殘留與ATP熒光值的相關性分析

啤酒在灌裝過程中應保證灌裝設備清潔干凈，所使用的灌裝容器必須經(jīng)過嚴格檢查和清洗，如不及時清洗，再加上較長時間不用，其中殘留的酒液就會腐敗發(fā)臭，嚴重影響啤酒的質量安全。因此，本部分研究建立啤酒殘留量的快速檢測方法，表3為不同稀釋梯度的純生啤酒對應的RLU值和殘留糖度。10 °P純生啤酒原液RLU檢測值為74，當稀釋至32倍時，稀釋樣品檢測與無菌水相同，RLU值為9。

圖2 水質污染微生物預測模型Fig.2 Prediction model of microorganism in water

表3 啤酒梯度稀釋樣品RLU值檢測結果Table 3 RLU value of serial dilution of beer

以酒樣稀釋梯度為橫坐標，RLU值為縱坐標，建立啤酒殘留量的預測模型，繪制標準曲線如圖3所示，并擬合線性回歸方程為y=66.525x+7.005(R2=0.994，P<0.005)。RLU值和啤酒稀釋倍數(shù)線性關系良好，利用此模型可對CIP或移動清洗(clean out of place，COP)程度進行評價。

圖3 啤酒有機質殘留預測模型Fig.3 Prediction model of organic matter residue from beer

3 結論

便攜式ATP生物發(fā)光法監(jiān)測系統(tǒng)應用十分廣泛，在生產(chǎn)設備清潔、消毒效果檢測、原輔料污染細菌總數(shù)檢測、HACCP、衛(wèi)生學監(jiān)測等方面均可發(fā)揮很好的實時監(jiān)控的作用。本試驗基于便攜式ATP生物發(fā)光快速檢測系統(tǒng)，在實驗室條件下分別建立表面短乳桿菌總數(shù)、水質短乳桿菌濃度和啤酒有機質殘留預測模型，其中，當表面短乳桿菌總數(shù)>1.1×102CFU、水質短乳桿菌濃度>3.5×101個/mL時可使用該檢測系統(tǒng)進行快速實時監(jiān)測，并進行細菌總數(shù)或濃度的預測，此外，也可對啤酒包裝車間啤酒殘留(殘留糖度>0.2 °Bx)進行預測。與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法相比，ATP生物發(fā)光法具有操作簡單、快速靈敏、綠色環(huán)保等優(yōu)點，但該方法檢測RLU值的穩(wěn)定性極易受到食品添加劑種類和周圍環(huán)境的影響，因此，目前該方法只作為食品加工企業(yè)自我衛(wèi)生監(jiān)控系統(tǒng)，可極大地提高環(huán)境清潔檢測的時效性和準確性，降低生產(chǎn)安全隱患發(fā)生的可能性。