孢懸液濃度和宿主體型大小對球孢白僵菌對松墨天牛幼蟲的致病力的影響

郭 涵,劉柱東,孫江華,3,*

(1.中國科學院動物研究所,農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室,北京 100101; 2.中國科學院大學,北京 100049;3.中國科學院生物互作卓越創(chuàng)新中心,北京 100049)

松墨天牛Monochamusalternatus，別稱松褐天牛，是重大森林植物檢疫性病害——松萎蔫病致病因子松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus的主要媒介昆蟲(Mamiya and Enda,1972;Linitetal.,1983;Togashi,1989)。該昆蟲在國內(nèi)分布于河北以南，西藏以東；南至廣東，東至臺灣；國外分布于日本、朝鮮、老撾、越南等國(楊寶君等,2003)。其寄主有馬尾松、濕地松、卡錫松、黑松、云南松、火炬松等，也可危害雪松、冷杉、云杉和落葉松(趙錦年和應杰,1989;周冰穎,2018)。該天牛幼蟲蛀食樹干和枝條的韌皮部及木質部，破壞組織，影響水分、養(yǎng)分運輸，嚴重危害松樹。松材線蟲，原產(chǎn)于北美地區(qū)，由松墨天牛攜帶傳播擴散，后傳播到日本、中國、韓國、墨西哥和葡萄牙等地，造成松樹大量枯萎死亡(Linit,1989)。我國于1982年在南京中山陵的黑松上首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲(楊寶君等,2003)，30年來蔓延擴散至18個省588個縣級行政區(qū)，最西抵達四川省涼山州，最北端在遼寧北部多個縣區(qū)，并已入侵多個國家級風景名勝區(qū)，累計發(fā)生面積約6.5萬公頃(http:∥www.forestry.gov.cn/main/3457/20190424/162731641935736.html)。松材線蟲不能自行傳播，必須借助媒介昆蟲天牛進行傳播擴散(Linit,1988)，因此，防治媒介昆蟲松墨天牛，是防控松材線蟲傳播擴散的有效途徑。

對松材線蟲病的治理主要是通過直接防治松材線蟲和間接防治松墨天牛(Kobayashietal.,1984;展茂魁等,2014)。目前采取的化學防治措施主要包括通過人工單株注干施藥方式殺滅松材線蟲和通過飛機空中施藥和地面機械噴藥殺滅松墨天牛(劉洪劍等,2007)?；瘜W藥劑會對環(huán)境產(chǎn)生污染，同時也會殺死大量昆蟲天敵，并且林間施用不便，防治效果差，生物防治松墨天牛成為研究重點，除利用信息素進行大規(guī)模誘殺外，還可以利用昆蟲天敵和病原真菌。如利用寄生天敵川硬皮腫腿蜂Sclerodermasichuanensis、花絨寄甲Dastarcushelophoroides和病原微生物白僵菌等防治天牛(崔永三,2011;楊遠亮等,2013)。

球孢白僵菌Beauveriabassiana是自然界廣泛存在的子囊菌類蟲生真菌(Quesadaetal.,2014)。白僵菌可寄生鱗翅目、鞘翅目、同翅目、膜翅目等700多種昆蟲，也因為其有廣泛的寄主范圍、較強的致病性和適應性等特點，成為了農(nóng)林業(yè)害蟲生物防治的最廣泛使用的蟲生真菌之一(季香云和楊長舉,2003;高紅等,2011)。致病機制是白僵菌通過孢子接觸到蟲體，產(chǎn)生芽管進入蟲體，其代謝物質擾亂昆蟲的角質層、細胞膜以及細胞核等細胞器的運作，導致昆蟲因代謝紊亂而死亡(Guptaetal.,1994;Duanetal.,2017)。白僵菌是日本應用最廣泛的真菌，自1991年日本日東電工發(fā)明了昆蟲病原真菌的無紡布載體培養(yǎng)技術，日本便開始生產(chǎn)白僵菌無紡布條以應用于松墨天牛等生物的防治(王濱等,2003)。我國也針對白僵菌防治松墨天牛展開了一系列研究。例如，孫繼美等(1997)和胡加付等(2006)先后篩選出對松墨天牛致病力高的菌株并應用于生產(chǎn)實踐;劉洪劍等(2007,2009)嘗試用媒介昆蟲如管氏腫腿蜂Sclerodermaguan攜帶和添加增效劑等方法提高白僵菌對松墨天牛感染率，取得了一定的效果。目前對于利用白僵菌防治松墨天牛的研究內(nèi)容主要包括優(yōu)良菌株的篩選、侵染途徑的優(yōu)化、感染機制和應用(孫繼美等,1997;胡加付等,2006;劉洪劍,2007,2009;詹偉軍,2013;陽飛等,2014)。對于松墨天牛本身，如蟲體大小，在利用白僵菌防治松墨天牛中產(chǎn)生的影響研究較少。本文探討了不同濃度的白僵菌對松墨天牛的致病能力和松墨天牛幼蟲蟲體的大小對施菌作用的影響，旨在為利用白僵菌防治松墨天牛提供應用。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲和真菌

松墨天牛幼蟲于2018年11月采自浙江富陽昌東村。每頭天牛編號、稱重和測量頭殼寬后置于10 mL的塑料離心管單管飼養(yǎng)，喂食馬尾松鋸末粉為主的半人工飼料(馬尾松鋸木粉200 g，瓊脂粉20 g，山梨酸1 g，對羥基苯甲酸2 g，抗壞血酸2 g，亞油酸12滴，水650 mL)，放置在4 ℃冰箱中長期保存?zhèn)溆?，期間每3個月更換一次人工飼料。

球孢白僵菌為商用球孢白僵菌孢子粉(BotaniGard 22WP)，由中國科學院動物研究所鄒振研究組提供。

1.2 球孢白僵菌對松墨天牛幼蟲的致病力試驗

1.2.1孢懸液濃度對球孢白僵菌致病力的影響：參照柳建定等(2012)和郭雅琦等(2015)的研究，將松墨天牛幼蟲分為5齡，其中4齡幼蟲頭殼寬范圍為2.2～3.0 mm，5齡幼蟲頭殼寬范圍為3.0～4.5 mm。根據(jù)齡期與頭殼寬的關系，選擇頭殼寬范圍為2.2～3.0 mm的的幼蟲，即4齡幼蟲用于本試驗。

本試驗探究不同濃度的白僵菌孢懸液對松墨天牛幼蟲適合度的影響，試驗設置了6個處理:0(CK),1×105,1×106,1×107,1×108和1×109孢子/mL濃度，其中對照(CK)為含0.5%吐溫-80的無菌水。參照雷妍圓等(2010)的浸蟲法，用含0.5%吐溫-80的無菌水將白僵菌孢子粉配制成濃度為0(CK),1×105,1×106,1×107,1×108和1×109孢子/mL的孢子懸浮液，用鑷子將供試幼蟲挑入菌液，浸漬10 s后挑出，幼蟲置于吸水紙上吸去多余水分，每10頭幼蟲為1個重復，各處理重復3次。

松墨天牛4齡幼蟲在用孢懸液處理后，與對照組一同置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，逐日觀察并記錄天牛幼蟲發(fā)病過程、死亡情況及白僵菌感染情況，統(tǒng)計校正死亡率和校正染菌率。當蟲體顏色變深紅后會逐漸僵硬，此時晃動養(yǎng)蟲管而蟲體不動時，即判定為死亡。在死亡后，蟲體保濕培養(yǎng)，觀察菌絲生長及產(chǎn)孢情況，挑片鏡檢并根據(jù)Dangi和Lim(2018)的描述方法提取蟲體體表菌絲體進行分子鑒定以確認是否為白僵菌感染致死。

1.2.2宿主體型大小對白僵菌致病力的影響：研究一定濃度白僵菌對不同體型大小的松墨天牛幼蟲的致病力。選用最佳感染濃度1×109孢子/mL，試驗設置6個處理，測定松墨天牛幼蟲的死亡率和染菌率。試驗幼蟲按大小分為100～150,200～220,300～320,400～420,500～520和600～650 mg/頭6組，每組隨機挑選30頭(3個重復，每個重復10頭幼蟲)相應大小的天牛幼蟲，用1×109孢子/mL濃度白僵菌孢懸液處理。松墨天牛幼蟲在用孢懸液處理后，每天觀察并記錄天牛幼蟲顏色變化、死亡情況及白僵菌感染情況，統(tǒng)計死亡率和染菌率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)試驗觀察，運用Excel記錄整理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0。百分數(shù)數(shù)據(jù)在分析前進行了反正弦轉換，然后利用K-S方法檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布；如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計分析，運用Duncan氏多重比較不同濃度的球孢白僵菌孢懸液處理后松墨天牛幼蟲的校正死亡率和染菌率的差異顯著性以及同一濃度球孢白僵菌孢懸液處理后不同大小蟲體松墨天牛幼蟲的死亡率和染菌率的差異顯著性；如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差非齊性，采用非參數(shù)分析，用Kruskal-WallisH方法進行檢驗。

2 結果

2.1 接種球孢白僵菌后松墨天牛4齡幼蟲的染菌發(fā)病過程

每天觀察發(fā)現(xiàn)，接種1×105～1×109孢子/mL球孢白僵菌孢懸液后的松墨天牛幼蟲起初正常扭動，充滿活力；隨后接菌天牛通常會行動緩慢，且表皮出現(xiàn)燒灼狀傷口；最后幼蟲死亡，蟲體長菌。蟲體長菌一般先從頭部開始，逐漸蔓延全身，最后口部也會蔓延出菌絲(圖1)。經(jīng)高濃度菌液(1×107,1×108和1×109孢子/mL)處理的幼蟲在染菌后出現(xiàn)的感染現(xiàn)象更為明顯和快速，且通過分子鑒定確定 為白僵菌感染[Length:571;Expect:0.0;Identities:545/545(100%);Gaps:0/545 (0%)]。

圖1 接種1×109孢子/mL球孢白僵菌孢懸液不同時間后松墨天牛4齡幼蟲的感染癥狀Fig.1 Symptoms of the 4th instar larvae of Monochamus alternatus infected by 1×109 conidia/mL Beauveria bassiana spore suspension for different days

2.2 不同濃度的球孢白僵菌孢懸液對松墨天牛4齡幼蟲的致病力

2.2.1孢懸液濃度對幼蟲死亡率的影響：各濃度的白僵菌孢懸液都可以成功侵染松墨天牛4齡幼蟲，但是不同濃度間存在差異，表現(xiàn)為濃度越大，天牛幼蟲死亡率越高(圖2:A)。天牛幼蟲第2天開始死亡，第6天為死亡高峰期。第1天接種0(CK),1×105,1×106,1×107,1×108和1×109孢子/mL孢懸液的天牛幼蟲的累計校正死亡率分別為0,0,0,6.67%,3.33%和10.00%，差異不顯著(H4=5.721,P=0.221)。從第2天開始，天牛幼蟲累計校正死亡率出現(xiàn)顯著性差異，表現(xiàn)為孢子濃度越高，天牛幼蟲死亡率越高(圖2:A)。接菌第7天，接種1×107,1×108和1×109孢子/mL孢懸液的天牛幼蟲的累計校正死亡率都達100.00%，而接種1×105孢子/mL孢懸液的天牛幼蟲的累計校正死亡率僅為21.43%(H4=13.745,P<0.01)。試驗結束時(15 d),0(CK),1×105,1×106,1×107,1×108和1×109孢子/mL各處理組累計校正死亡率分別為10.00%,53.33%,100.00%,100.00%,100.00%和100.00%(H4=13.796,P<0.01)。

2.2.2孢懸液濃度對幼蟲染菌率的影響：接種不同濃度的球孢白僵菌后，松墨天牛4齡幼蟲的染菌狀況與染菌濃度和染菌時間有著密切的關系，濃度越大，幼蟲累計校正染菌率越高(圖2:B)。經(jīng)處理的天牛幼蟲從第2天開始長菌絲，從第4天開始累計校正染菌率開始出現(xiàn)顯著性變化，1×105孢子/mL處理中天牛幼蟲累計校正染菌率最低(圖2:B)。試驗結束時(第15天)，1×106～1×109孢子/mL組中幼蟲累計校正染菌率都在85.00%以上，而最低濃度(1×105孢子/mL)處理下幼蟲累計校正染菌率為20.00%，與對照(染菌率為0)間差異顯著(F4,10=15.306,P<0.01)。

圖2 不同球孢白僵菌接種濃度下松墨天牛4齡幼蟲的累計校正死亡率(A)和染菌率(B)Fig.2 Accumulative corrected mortality rate (A) and infection rate (B) of the 4th instar larvae of Monochamus alternatus inoculated with different concentrations of Beauveria bassianaC1:1.0×105孢子/mL 1.0 × 105 Conidia/mL;C2:1.0×106孢子/mL 1.0 × 106 Conidia/mL;C3:1.0×107孢子/mL 1.0 × 107 Conidia/mL;C4:1.0×108孢子/mL 1.0 × 108 Conidia/mL;C5:1.0×109孢子/mL 1.0 × 109 Conidia/mL.統(tǒng)計檢驗采用單因素方差分析(ANOVA)和Kruskal-Wallis H檢驗Statistical tests used one-way analysis of variance (ANOVA) and Kruskal-Wallis H test.

2.3 松墨天牛幼蟲體型大小對球孢白僵菌孢懸液致病力的影響

2.3.1體型大小對幼蟲死亡率的影響：總體上看，在濃度為1×109孢子/mL的球孢白僵菌孢懸液的處理下，不同體型大小的松墨天牛幼蟲的死亡率隨體重的升高而明顯增加(圖3:A)。經(jīng)球孢白僵菌處理的天牛幼蟲第2天開始死亡，第2-10天期間，不同體型大小的天牛幼蟲死亡率無顯著差異(P>0.05);第20天時，體重較低的天牛幼蟲(100～320 mg/頭)死亡率較低，體重較高的天牛幼蟲(400～650 mg/頭)死亡率較高，兩者差異顯著(H5=12.860,P=0.025)(圖3:A)。

圖3 接種1×109孢子/mL球孢白僵菌后不同體型大小的松墨天牛幼蟲的累計死亡率(A)和染菌率(B)Fig.3 Accumulative mortality rate (A) and infection rate (B) of Monochamus alternatus with different body size after inoculation with 1×109 conidia/mL of Beauveria bassiana統(tǒng)計檢驗采用單因素方差分析(ANOVA)和Kruskal-Wallis H檢驗。Statistical tests used one-way analysis of variance (ANOVA) and Kruskal-Wallis H test.

2.3.2體型大小對幼蟲染菌率的影響：在濃度為1×109孢子/mL的球孢白僵菌孢懸液的處理下，不同體型大小的松墨天牛幼蟲的染菌率隨體重的升高而明顯增加(圖3:B)。在長菌的過程中，體型大的天牛幼蟲相較于體型小的出現(xiàn)了更高的染菌率。天牛幼蟲第3天體表開始出現(xiàn)菌絲，第6-20天，不同處理的天牛染菌率出現(xiàn)顯著差異，表現(xiàn)為大個體天牛幼蟲的染菌率顯著比小個體天牛幼蟲高(P<0.05)(圖3:B)。試驗結束(第20天)時，體型大小分別為100～150,200～220,300～320,400～420,500～520和600～650 mg/頭的天牛幼蟲染菌率分別為60.00%,63.33%,60.00%,86.67%,96.67%和100.00%(F5,12=8.521,P<0.01)。

3 討論

本研究結果表明，球孢白僵菌孢懸液對松墨天牛幼蟲具有良好活性，其效果與孢懸液的濃度和天牛幼蟲的大小有關。通過對比不同濃度的孢懸液處理后松墨天牛4齡幼蟲的死亡率和染菌率發(fā)現(xiàn)，接種較高濃度孢懸液對松墨天牛幼蟲的致病力較強。濃度為1×109孢子/mL時對天牛幼蟲的感染力最高，發(fā)病最快，表現(xiàn)為第3-5天出現(xiàn)死亡高峰，在第5-6天出現(xiàn)蟲體長菌絲的高峰期(圖2)。同時，在相同濃度(1×109孢子/mL)的球孢白僵菌孢懸液處理下，個體較大的松墨天牛幼蟲的發(fā)病率顯著高于個體較小的幼蟲，在感染率上明顯上升，約為其兩倍(圖3)。這些研究結果將為松墨天牛的治理提供思考。

許多研究表明，球孢白僵菌在森林病蟲害防治中發(fā)揮著不可替代的作用。日本自20世紀90年代便開始生產(chǎn)白僵菌用于生物防治(王濱等,2003)，我國也在其后篩選出松墨天牛高致病力菌株并應用在生產(chǎn)實踐中(孫繼美等,1997)。然而，在實際應用中，白僵菌的防治效果受多方面因素的影響，如紫外線、雨水、溫度、濕度、區(qū)域和天牛本身的鉆蛀危害習性(Walsteadetal.,1970)，使得孢子較難進入樹木坑道、侵染天牛幼蟲。借助天敵昆蟲攜帶白僵菌孢子，如管氏腫腿蜂，將白僵菌傳入隱蔽性危害的松墨天牛幼蟲的坑道內(nèi)，進而侵染天牛，并且已有報道證實白僵菌和天敵聯(lián)合施用的防治效果高于單一方法的防治效果(王功桂等,2004;劉洪劍等,2007)。根據(jù)白僵菌濃度越高，天牛幼蟲發(fā)病越快、染菌率越高的特點，在利用白僵菌防治松墨天牛的過程中，對松墨天牛發(fā)生重災區(qū)，建議選配1×109孢子/mL白僵菌快速高效地侵染松墨天牛幼蟲，快速降低松墨天牛蟲口密度，減輕天牛幼蟲對松樹韌皮的危害，保護松樹的同時阻斷松材線蟲的傳播。而對松墨天牛的一般發(fā)生區(qū)(松墨天牛的危害對松樹不致死情況下)，可選配1×107孢子/mL白僵菌，持續(xù)侵染松墨天牛，將松墨天牛的蟲口密度控制在經(jīng)濟閾值以下。此外，發(fā)病進度表明松墨天牛一旦染菌，通常在10 d內(nèi)死亡，為林間白僵菌施用的頻次提供指導。由于松墨天牛世代重疊，幼蟲發(fā)育不整齊，每年的5-10月林間均有不同大小幼蟲(郭雅琦等,2015)，建議利用白僵菌進行生物防治時，白僵菌的使用頻次以半月為宜。

在使用球孢白僵菌防治松墨天牛中，除了考慮施菌的濃度和時間，還需考慮天牛體型的大小。本試驗發(fā)現(xiàn)，松墨天牛幼蟲的體型大小也影響球孢白僵菌的侵染效果，表現(xiàn)為個體大的天牛染菌率更高(圖3)。通常認為試蟲個體越大，對病菌的抗性越強，越不容易感病(詹偉君等,2013)。試驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)，天牛幼蟲在接種球孢白僵菌后，蟲體扭動加劇，推測大個體天牛幼蟲染菌率高的原因可能是天牛幼蟲越大，扭動越不靈活，不能及時除去沾在體表的孢子，從而更容易被球孢白僵菌侵染。利用白僵菌對不同大小天牛的侵染差異特點，采用管氏腫腿蜂與白僵菌協(xié)同防治松墨天牛將是更好的策略。二者可以在時間上互補協(xié)同控害，腫腿蜂的寄生最佳時期為松墨天牛幼蟲的2-3齡期(王功桂等,2004)，而白僵菌對高齡幼蟲更有效；此外，前人研究表明管氏腫腿蜂和白僵菌可聯(lián)合使用，不產(chǎn)生負影響(de la Rosaetal.,2000;劉洪劍等,2007)，為共同使用防治松墨天牛提供了依據(jù)。

本試驗中，用不同濃度球孢白僵菌處理，松墨天牛幼蟲在發(fā)病時間上會出現(xiàn)差異，呈現(xiàn)出濃度越大發(fā)病越早的趨勢(圖2)；對于不同體重的幼蟲，受球孢白僵菌侵染后其發(fā)病時間也不同，呈現(xiàn)蟲體越大發(fā)病越早的趨勢(圖3)。本試驗中濃度的試驗和體型大小的試驗是相互獨立的試驗，但1×109孢子/mL孢子濃度在前后試驗中表現(xiàn)出了致病力的差異，濃度試驗中發(fā)病早，而體型大小試驗中發(fā)病晚(圖2和3)。分析原因，我們認為有兩點值得商討：其一，白僵菌的致病力可能存在季節(jié)性變化，在兩個獨立試驗處理中，濃度試驗在7月實施，而個體大小試驗在次年1月實施，病原微生物致病力的季節(jié)性變化可能導致了前后試驗結果的差異，如已有報道證實檸條根系中叢枝菌根真菌致病力呈季節(jié)性變化(劉永俊等,2009)；其二，白僵菌孢子致病力可能與白僵菌孢子粉保存的溫度、保存的時間和方式有關系，隨著保存時間加長，孢子的活性下降從而致病力降低(張力泉等,2019)。