擴(kuò)頭蔡白蟻腸道蛋白的鑒定

蘇麗娟,伍志偉,高新浩,趙鵬飛,肖元璽,楚君鵬,宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450002)

木質(zhì)纖維素是地球上非常富有的可再生生物質(zhì)資源，主要由纖維素、木質(zhì)素和半纖維素等成分組成(相輝和周志華,2009)，但是，生物質(zhì)資源的利用和轉(zhuǎn)化受到原料自身抗降解屏障特性的影響，成為制約其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要障礙，因此，探索自然生物系統(tǒng)中能夠高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素的技術(shù)體系成為解決這一瓶頸的重要途徑。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有100多種昆蟲(chóng)被證實(shí)具有明顯的消化木質(zhì)纖維素的能力，比如蜚蠊目的食木蟑螂Panesthiacribrata和白蟻、纓尾亞目的蠹蟲(chóng)、鞘翅目的天牛等(Martin,1983;Slaytor,1992;Lawtonetal.,1996;Mohr and Tebbe,2006)，在這些昆蟲(chóng)中，白蟻消化木質(zhì)纖維素的效率最高，可以在24 h內(nèi)消化攝入植物中高達(dá)99%的纖維素，而其他食木昆蟲(chóng)對(duì)纖維素的消化率只有12%～68%(Sun and Scharf,2010)。如此高效的木質(zhì)纖維素消化能力使白蟻成為研究高效利用木質(zhì)纖維素資源的熱點(diǎn)，研究者希望通過(guò)對(duì)白蟻的研究，發(fā)掘新型、天然、高效的木質(zhì)纖維素酶，了解白蟻腸道內(nèi)酶對(duì)木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化特征，解開(kāi)昆蟲(chóng)腸道轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素之謎，為高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素為生物能源及生物基產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。白蟻(工蟻)消化道呈螺旋形，主要由前腸、中腸和后腸3部分組成(Brune and Stingl,2006)。白蟻后腸相當(dāng)發(fā)達(dá)，約占全部腸道總?cè)莘e的4/5之多，主要負(fù)責(zé)吸收水份、無(wú)機(jī)鹽及排除代謝廢物等(Schmitt-Wagneretal.,2003;陳虹等,2005;蘇麗娟等,2011)。因此，白蟻?zhàn)鳛樾⌒蛣?dòng)物生物反應(yīng)器，由進(jìn)行物理消化的研磨器(具有強(qiáng)大咀嚼能力的口器)和生化消化的反應(yīng)池(即消化道)組成，生化消化主要是指由復(fù)雜的微生物區(qū)系和木質(zhì)纖維素酶系參與的木質(zhì)纖維素的降解和轉(zhuǎn)化(Zhouetal.,2007)。

迄今為止人們對(duì)白蟻纖維素酶系統(tǒng)的研究主要分兩類(lèi)，一是用基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)的方法對(duì)木質(zhì)纖維素降解酶進(jìn)行鑒定和甄別，二是對(duì)酶進(jìn)行基因克隆、表達(dá)或者分離純化后測(cè)定其酶學(xué)特性，希望對(duì)這些酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供資料。比如，研究者對(duì)低等白蟻如北美散白蟻Reticulitermesflavipes、達(dá)爾文澳白蟻Mastotermesdarwiniensis、山林原白蟻Hodotermopsissjostedti、恒春新白蟻Neotermeskoshunenses和黃胸散白蟻Rhticulitermessperatus等的腸道微生物的酶系和酶蛋白進(jìn)行了研究(Zhouetal.,2007;Tartaretal.,2009;Hongoh,2010;Franco Cairoetal.,2011;Xieetal.,2012)，也對(duì)高等白蟻鋸白蟻屬的Microcerotermessp.、Trinervitermestrinervoides及象白蟻Nasutitermes的囊形胃內(nèi)容物等進(jìn)行宏基因組學(xué)分析(Zhangetal.,2009;Watanabe and Weissman,2010;Nimchuaetal.,2012;Rashamuseetal.,2017)，白蟻腸道內(nèi)容物中發(fā)現(xiàn)的纖維素酶最多，也有木聚糖水解酶、果膠酶和淀粉酶，包括纖維素酶(GH1,GH3,GH5,GH7,GH9和CBM6等)，半纖維素酶(GH2,GH8,GH10,GH11,GH16,GH43和CBM 27等)和果膠酶(GH28和GH29等)，這些酶多為內(nèi)源性纖維素酶。另外，研究者用不同方法克隆和表達(dá)了一些白蟻的木質(zhì)纖維素酶基因，例如：對(duì)北美散白蟻R.flavipes的研究最多，包括3個(gè)來(lái)自于白蟻后腸原生動(dòng)物的纖維素酶GHF7-3,GHF7-5和GHF7-6(Sethietal.,2013)，腸道中分離到的漆酶亞型RfLacA和RfLacB(Coyetal.,2010)，唾液腺分泌的內(nèi)源性內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶RsEG(Hirayamaetal.,2010)；黃胸散白蟻的GH45家族的內(nèi)切β-1,4-糖苷酶(Otagirietal.,2013)和木糖異構(gòu)酶(Katahiraetal.,2017)；乳白蟻屬臺(tái)灣乳白蟻Coptotermesformosanus的兩種內(nèi)源性BG同源物CfGlu1B和CfGlu1C(Fengetal.,2015);高山象白蟻Nasutitermestakasagoensis后腸的NtEG可水解纖維素糊精的β-1,4-纖維素鏈成纖維二糖和葡萄糖(Hirayamaetal.,2010);象白蟻屬Nasutitermescorniger的工蟻和兵蟻腸道提取物中檢測(cè)到了多種纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶)、半纖維素酶(β-木聚糖酶,α-l-阿拉伯呋喃糖酶,β-d-木聚糖酶)、α-淀粉酶、蛋白酶(trypsin-like,chymotrypsin-like,keratinase-type)(Limaetal.,2014);黑翅土白蟻Odontotermesformosanus的腸道真菌產(chǎn)生的纖維素酶具有Eg酶和β-1,4-糖苷酶活性(Duanetal.,2017)。

經(jīng)過(guò)近幾十年的研究，人們對(duì)白蟻腸道內(nèi)容物中降解木質(zhì)纖維素的機(jī)理有了較為深刻的理解，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要進(jìn)一步的研究。本研究用雙向電泳(2-DE)和MALDI-TOF/MS測(cè)序聯(lián)用的方法直觀顯示了擴(kuò)頭蔡白蟻Tsaitermesampliceps腸道及其內(nèi)容物的蛋白構(gòu)成及這些蛋白在前中腸和后腸的表達(dá)差異，并對(duì)測(cè)到的木質(zhì)纖維素酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，為理解白蟻降解木質(zhì)纖維素的機(jī)理，挖掘白蟻生物系統(tǒng)中的高效降解酶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白蟻采集及腸道內(nèi)容物提取

擴(kuò)頭蔡白蟻采自河南省信陽(yáng)商城縣金剛臺(tái)鄉(xiāng)(31°79′N(xiāo),115°50′E)，采集到的擴(kuò)頭蔡白蟻首先進(jìn)行物種鑒定，然后在黑暗、22～30℃、潮濕(濕度>50%)的條件下飼養(yǎng)，取數(shù)千頭(前中腸4 000頭、后腸1 000頭)擴(kuò)頭蔡白蟻工蟻，用解剖針從擴(kuò)頭蔡白蟻腹尖輕輕拉出腸道(圖1)，分離前中腸和后腸，放入0.2 mol/L PBS溶液中，勻漿腸道及其內(nèi)容物樣品(冰上操作)，2 000 r/min 4℃離心30 min，吸取上清。

圖1 擴(kuò)頭蔡白蟻工蟻腸道解剖示意圖Fig.1 Anatomy sketch of Tsaitermes ampliceps worker gutO:食道Oesophagus;C1:嗉囊Crop;CV:賁門(mén)瓣Cardiac valve;P1:前胃Proventriculus;Mg:中腸Midgut;T:馬氏管Malpighian tubules;U:腸道瓣前節(jié)Segment preceding the enteric valve;P2:囊形胃Paunch;C2:結(jié)腸Colon;R:直腸Rectum.

1.2 腸道內(nèi)容物蛋白提取和純化

將1.1節(jié)獲得的粗蛋白溶液用0.22 μm Micro PES樹(shù)脂(用MillQ水濕潤(rùn)過(guò))過(guò)濾，加入1/4體積的50% TCA-丙酮(5 g三氯乙酸，加去離子水溶解，定容至10 mL)，冰浴。離心棄上清，加入冰丙酮(內(nèi)含0.01 mol/L DTT，保存在-20℃冰箱中)，冰浴。4℃ 12 000 r/min離心30 min，棄上清。加入蛋白提取液[SDS 0.15 g,1 mol/L Tris-HCl (pH 7.6) 1.5 mL,DTT 0.015 g,0.5 mol/L EDTA-Na20.1 mL,蔗糖3 g,加MillQ水定容至10 mL]，40～50℃加熱30 min，溶解沉淀，20℃ 12 000 r/min離心30 min，棄上清。加入0.1 mol/L乙酸銨甲醇溶液(乙酸銨0.77 g，加入甲醇溶解并定容至100 mL)渦旋混勻，冰浴離心，棄上清。再用冰甲醇溶液(內(nèi)含0.01 mol/L DTT，保存在-20℃冰箱中)清洗固體沉淀。加入含有尿素、硫脲和CHAPS等試劑的裂解液(尿素4.2 g,硫脲1.52 g,CHAPS 0.4 g) 15℃ 220 r/min震蕩溶解30～60 min，樣品蛋白質(zhì)濃度采用Bradford(1976)法測(cè)定，確保蛋白樣品濃度1 μL≥12 μg蛋白量，之后放在-20℃冰箱保存。

1.3 雙向電泳

1.2節(jié)蛋白樣品置室溫溶解，加入0.01 g DTT充分混勻即為水化上樣緩沖液。取出冷凍保存的線性IPG預(yù)制膠條(11 cm,pH 4-7)，室溫放置10 min，沿著聚焦盤(pán)的邊緣從左到右線性加入等量(體積和質(zhì)量)的蛋白樣品 (在槽兩端各1 cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫且不要有氣泡，否則會(huì)影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品都加入到聚焦盤(pán)中后，用鑷子輕輕地去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。分清正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中樣品溶液上，使得膠條的正極(標(biāo)有+)對(duì)應(yīng)于聚焦盤(pán)的正極。在每根膠條上覆蓋礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。需緩慢地加入礦物油，沿著膠條使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上，對(duì)好正負(fù)極，設(shè)置等電聚焦程序。

等電聚焦程序?yàn)椋弘娏鞅ＷC不超過(guò)50 μA,S1 50 V主動(dòng)水化12 h→S2 200 V線性1 h→S3 1 000 V快速1 h→S4 9 000 V線性2 h升壓→S5 9 000 V聚焦8 h→S6 500 V快速，可以保持12 h，聚焦結(jié)束的膠條立即用平衡緩沖I和平衡緩沖液Ⅱ進(jìn)行平衡。配制12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳。恒溫15℃，先用低電壓100 V/gel/11 cm、后用200 V/gel/11 cm電泳，考馬斯亮藍(lán)R250溶液染色膠，冰乙酸脫色后凝膠成像。

1.4 生物信息學(xué)分析和MALDI-TOF/MS測(cè)序

染色后的凝膠用ImageScanner掃描，用PDQuest軟件分析圖譜，分析白蟻前中腸和后腸中的高表達(dá)和差異表達(dá)蛋白，確認(rèn)其顯著差異的蛋白(灰度比值大于2)。用雙向電泳的至少2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)計(jì)算樣品膠中蛋白質(zhì)點(diǎn)分子量和等電點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)值。選取高表達(dá)和顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，用滅過(guò)菌和去頭的黃色槍頭沿著染色邊緣切下差異蛋白點(diǎn)放入Eppendorf管中，進(jìn)行蛋白質(zhì)溶解，由上海博苑科技生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

用MALDI-TOF/MS的數(shù)據(jù)采集軟件Flexcontro.1 3.0對(duì)樣品孔的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，每孔取10個(gè)進(jìn)行激光點(diǎn)擊其不同位置。運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)World-2D PAGE,UniProt,ExPASy,NCBI和GenBank等通過(guò)數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)手段對(duì)生物信息進(jìn)行收集、加工、存儲(chǔ)、分析與解析方法來(lái)詮釋實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通過(guò)Cn3D 4.3軟件預(yù)測(cè)了酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，并用SignalP 4.1 Server軟件分析了5個(gè)蛋白的信號(hào)肽序列信息。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)頭蔡白蟻腸道及其內(nèi)容物蛋白的電泳結(jié)果

擴(kuò)頭蔡白蟻前中腸和后腸及其內(nèi)容物蛋白的雙向電泳圖譜如圖所示(圖2:A,B)，從圖中可以看出，蛋白點(diǎn)清晰透亮種類(lèi)多，且白蟻前中腸內(nèi)容物蛋白與后腸的差異明顯，適合對(duì)白蟻前中腸和后腸內(nèi)容物蛋白進(jìn)行差異比對(duì)研究。用PDQuest軟件分析發(fā)現(xiàn)，白蟻前中腸有182個(gè)可分辨蛋白點(diǎn)，后腸有108個(gè)可分辨蛋白點(diǎn)，其中有28個(gè)蛋白在前中腸和后腸均高效表達(dá)、78個(gè)蛋白僅在前中腸表達(dá)、37個(gè)蛋白僅在后腸表達(dá)，排除獨(dú)有的蛋白點(diǎn)，有23個(gè)蛋白在前中腸的表達(dá)量大于后腸的2倍、31個(gè)蛋白在后腸的表達(dá)量大于前中腸的2倍。圖2(C)為加1%CMC-Na篩選底物的SDS-PAGE電泳圖譜，從圖中可以看出白蟻腸道內(nèi)容物纖維素降解酶的分子量大小范圍，前中腸的蛋白分子量分別為在25～28 kD和43～85 kD范圍內(nèi)，后腸的在35～85 kD范圍內(nèi)，所以該篩選圖譜可以為扣點(diǎn)測(cè)序的蛋白分子量范圍提供有力的依據(jù)。

圖2 擴(kuò)頭蔡白蟻腸道及其內(nèi)容物蛋白的雙向電泳圖譜Fig.2 2-DE analysis of proteins in the gut including gut contents of Tsaitermes amplicepsA:前中腸蛋白Proteins in the fore- and midgut;B:后腸蛋白Proteins in the hindgut.圖中的數(shù)字為進(jìn)行扣點(diǎn)測(cè)序的蛋白，數(shù)字的顏色表示蛋白的功能(黑色示結(jié)構(gòu)蛋白；藍(lán)色示調(diào)節(jié)蛋白；粉紅色示白蟻代謝蛋白；紅色示微生物代謝蛋白；黃色示未測(cè)出蛋白)。The number shows the proteins selected to sequence.The color of number shows the function of proteins (black showing the structural proteins,blue showing the regulatory proteins,pink showing the metabolism-related proteins in termites,red showing the metabolism-related proteins in microorganism,and yellow showing the undetected proteins).C:加1%CMC-Na篩選底物的SDS-PAGE電泳圖譜The SDS-PAGE figure when adding 1% CMC-Na as the substrate.

2.2 擴(kuò)頭蔡白蟻腸道及其內(nèi)容物蛋白的鑒定

對(duì)高表達(dá)或高差異表達(dá)的47個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行扣點(diǎn)和MALDI-TOF/MS測(cè)序，成功匹配出39個(gè)蛋白，表1是通過(guò)MS/MS分析前中腸和后腸的差異蛋白功能信息，從表中可以看出測(cè)序蛋白可以分為4類(lèi)：(1)結(jié)構(gòu)蛋白：1個(gè)副肌球蛋白(圖2中16)、1個(gè)角蛋白1(圖2中37)、2個(gè)原肌球蛋白(圖2中6和7)、5個(gè)肌動(dòng)蛋白(圖2中24,25,34,36和44)、4個(gè)昆蟲(chóng)儲(chǔ)存蛋白(圖2中1,2,13和14)；(2)調(diào)節(jié)蛋白：1個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白(圖2中15)、1個(gè)致死蛋白2(圖2中35)、1個(gè)鈣調(diào)素蛋白(圖2中32號(hào)假定蛋白與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān))、2個(gè)儲(chǔ)鐵蛋白(圖2中28和42)、4個(gè)熱激蛋白(圖2中17,19,22和40)；(3)白蟻代謝蛋白：1個(gè)E4酯酶(圖2中26)、1個(gè)脯氨酸二肽酶(圖2中27)、2個(gè)內(nèi)源性纖維素酶(圖2中3和4)、3個(gè)精氨酸激酶(圖2中9,29和30，其中29號(hào)假定蛋白預(yù)測(cè)為精氨酸激酶)和3個(gè)二硫化物異構(gòu)酶(圖2中11,18和33)；(4)腸道內(nèi)容物微生物代謝蛋白：1個(gè)內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶(圖2中5)、1個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(圖2中39)、1個(gè)β-內(nèi)酰胺酶(圖2中41號(hào)蛋白有β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)域)、1個(gè)超氧化物歧化酶(圖2中46)、1個(gè)糖基水解酶11家族(圖2中45)和2個(gè)醛酮還原酶(圖2中8和31)。其中結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白和白蟻代謝蛋白等內(nèi)源性蛋白32個(gè)，占匹配成功蛋白82.1%；外源性蛋白即微生物代謝蛋白7個(gè)，占17.9%，從功能蛋白的種類(lèi)和數(shù)量上可以判斷內(nèi)源性蛋白多于外源性蛋白。

2.3 擴(kuò)頭蔡白蟻前中腸與后腸差異表達(dá)蛋白的比較

匹配出的39個(gè)蛋白中，在前中腸和后腸均高效表達(dá)有11個(gè)，其中4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，3個(gè)微生物代謝蛋白，主要有儲(chǔ)存蛋白、肌球蛋白、醛酮還原酶等，表明白蟻前中腸和后腸在日常生活中均需要儲(chǔ)存自身所需要的蛋白以及防止共價(jià)大分子結(jié)合的損害。僅在前中腸表達(dá)的蛋白有12個(gè)，其中6個(gè)白蟻代謝蛋白，主要有內(nèi)源性纖維素酶、二硫化物異構(gòu)酶、E4酯酶等，推測(cè)白蟻在前中腸主要進(jìn)行能量代謝活動(dòng)，尤其是內(nèi)源性纖維素的降解。僅在后腸表達(dá)的蛋白有8個(gè)，主要是微生物代謝蛋白，有糖基水解酶第十一家族、超氧化物歧化酶等，表明白蟻在后腸主要參與半纖維素和木質(zhì)素的降解。蛋白在前中腸的表達(dá)量大于后腸2倍的有5個(gè)，其中有4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，主要是肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白等，表明白蟻需要在前中腸儲(chǔ)存所需蛋白。蛋白在后腸的表達(dá)量大于前中腸的2倍有3個(gè)，主要有熱休克蛋白、脯氨酸二肽酶等。以上信息在消化代謝方面可以得出白蟻前中腸主要進(jìn)行白蟻代謝活動(dòng)，后腸進(jìn)行微生物代謝活動(dòng)，可以推測(cè)白蟻吞食木頭后，在前中腸進(jìn)行初步消化降解，經(jīng)過(guò)后腸微生物代謝進(jìn)一步降解，形成微生物蛋白，再通過(guò)肛哺飼喂其他白蟻。

2.4 擴(kuò)頭蔡白蟻腸道木質(zhì)纖維素降解酶的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

從表1中可以看出參與木質(zhì)纖維素降解和代謝相關(guān)的酶或非酶蛋白主要有5個(gè)(表1中3,4,5,45和46)，通過(guò)Cn3D 4.3軟件預(yù)測(cè)4個(gè)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)(表1中4,5,45和46)(圖3)，圖3(A)是白蟻內(nèi)源性纖維素酶[GH9家族內(nèi)切葡聚糖酶，(α/α)6結(jié)構(gòu)]；圖3(B)是白蟻內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶[GH9家族內(nèi)切葡聚糖酶，(α/α)6結(jié)構(gòu)]；圖3(C)是GH11家族木聚糖酶[內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶，β-jelly roll結(jié)構(gòu)；三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)可能為GH11/GH12)]，由白蟻共生不可培養(yǎng)原生動(dòng)物產(chǎn)生的；圖3(D)是Cu-Zn SOD(β-sandwich結(jié)構(gòu))，來(lái)源于雙翅目果蠅科的Scaptodrosophilalebanonensis。為了更深入地了解這幾個(gè)蛋白，用SignalP 4.1 Server軟件分析了5個(gè)蛋白的信號(hào)肽序列信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1個(gè)內(nèi)源性纖維素酶的蛋白信號(hào)肽概率0.885，最大分隔位點(diǎn)概率是0.450，酶切位點(diǎn)位于第18與19位氨基酸之間；1個(gè)內(nèi)源性纖維素酶的信號(hào)肽概率0.845，最大分隔位點(diǎn)概率是0.450，酶切位點(diǎn)位于第16與17位氨基酸之間；1個(gè)糖基水解酶11家族的蛋白信號(hào)肽概率0.546，最大分隔位點(diǎn)概率是0.450，酶切位點(diǎn)位于第22與23位氨基酸之間；1個(gè)內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶和1個(gè)超氧化物歧化酶的信號(hào)肽概率分別為0.115和0.099，最大分隔位點(diǎn)概率是0.450，預(yù)測(cè)不到其酶切位點(diǎn)。

圖3 擴(kuò)頭蔡白蟻腸道木質(zhì)纖維素降解酶的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Protein structure prediction of lignocellulolytic enzymes in the gut of Tsaitermes amplicepsA:白蟻內(nèi)源性纖維素酶[GH9家族內(nèi)切葡聚糖酶，(α/α)6結(jié)構(gòu)]Endogenous cellulose from termites [GH9s,(α/α)6];B:白蟻內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶[GH9家族內(nèi)切葡聚糖酶(α/α)6結(jié)構(gòu)] Endo-beta-1,4-glucanase HsEG4 from termites [GH9s,(α/α)6];C:來(lái)源于不可培養(yǎng)微生物的內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶(GH11家族木聚糖酶，β-jelly roll結(jié)構(gòu))Endo-β-1,4-xylanase (GH11,β-jelly roll) from uncultured microorganism;D:來(lái)源于互利共生微生物的Cu-Zn SOD(β-sandwich結(jié)構(gòu))Cu-Zn SOD (β-sandwich) from mutualistic microorganisms.

表1 MALDI-TOF/MS分析擴(kuò)頭蔡白蟻前中腸和后腸(含腸道內(nèi)含物)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)信息Table 1 Basic information of differentially expressed proteins identified by MALDI-TOF/MS between the fore- and midgut and the hindgut (including gut contents) of Tsaitermes ampliceps

3 討論

由于白蟻材料的特殊性，使得白蟻腸道內(nèi)容物(前中腸和后腸)蛋白提取比較困難，本實(shí)驗(yàn)對(duì)白蟻腸道內(nèi)容物雙向電泳蛋白的提取和純化方法進(jìn)行了摸索。首先用腸道微生物蛋白提取方法提取白蟻腸道內(nèi)容物蛋白，雙向電泳圖譜上的蛋白點(diǎn)大部分聚集在SDS-PAGE凝膠的靠上部分，存在這種現(xiàn)象的原因是可能等電聚焦不充分、SDS-PAGE電泳時(shí)間稍少、裂解液內(nèi)含有NaCl和SDS等離子試劑、白蟻腸道內(nèi)容物提取的特殊性等。并對(duì)白蟻和蝗蟲(chóng)腸道微生物蛋白提取進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)相同實(shí)驗(yàn)方法和總蛋白量的白蟻的雙向電泳圖譜比蝗蟲(chóng)的蛋白點(diǎn)少得多，可能是由于白蟻腸道過(guò)于纖細(xì)，無(wú)法剝離，勻漿后殘留腸壁組織、脂肪、核酸及糖類(lèi)等雜質(zhì)。然后采用植物組織蛋白提取方法(耿旭等,2010)并進(jìn)行改進(jìn)，比如增加pH 8.0 Tris-平衡酚，可以有效地使蛋白和其他雜質(zhì)分開(kāi)，從而達(dá)到純化的目的，但是雙向電泳圖譜顯示并不理想。最后增加Micro PES樹(shù)脂過(guò)濾蛋白的提取方法，使蛋白與雜質(zhì)分開(kāi)，使蛋白樣品損失較少，蛋白點(diǎn)清晰透亮，白蟻前中腸和后腸蛋白差異明顯，便于后續(xù)差異蛋白的扣點(diǎn)和測(cè)序分析。

續(xù)表1 Table 1 continued

通過(guò)UniProt,ExPASy,NCBI和GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)分析匹配成功的39個(gè)蛋白點(diǎn)，預(yù)測(cè)擴(kuò)頭蔡白蟻前中腸與后腸差異蛋白功能，這些蛋白包括結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白、白蟻代謝蛋白和白蟻腸道微生物代謝蛋白四大類(lèi)；從測(cè)序的蛋白可以看出結(jié)構(gòu)蛋白占總測(cè)得蛋白的1/3，主要有儲(chǔ)存蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白等(表1)。儲(chǔ)存蛋白是昆蟲(chóng)普遍存在的一種特異性血淋巴蛋白，通常在幼蟲(chóng)的脂肪體內(nèi)合成，釋放到血淋巴中，之后被脂肪體選擇性吸收，作為氨基酸的貯存庫(kù)，并對(duì)成蟲(chóng)發(fā)育和雌性卵發(fā)育起重要的作用(馬彩霞等,2002)。肌動(dòng)蛋白與整合蛋白結(jié)合在一起，組成細(xì)胞的骨架，展示特有的物理和空間結(jié)構(gòu)特征(Geigeretal.,2009)。擴(kuò)頭蔡白蟻中高表達(dá)或高差異表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白有9個(gè)，主要有熱激蛋白、鈣調(diào)素蛋白、儲(chǔ)鐵蛋白等(表1)。其中熱激蛋白是生物體在不利環(huán)境因素刺激下應(yīng)激合成的一組進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)(曲凌云等,2004)。鈣調(diào)素(CaM)作為最重要的一類(lèi)Ca2+傳感蛋白可通過(guò)與其下游的CaM結(jié)合蛋白(CaMBP)作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。因此CaMBP的研究是揭示CaM作用機(jī)制的重要內(nèi)容，是探明Ca2+-CaM信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的關(guān)鍵。因此白蟻?zhàn)陨矸置谡{(diào)節(jié)蛋白主要是白蟻受到外界干擾或自身信號(hào)傳導(dǎo)的影響。

白蟻代謝蛋白主要包括木質(zhì)纖維素降解酶、精氨酸激酶、醛酮還原酶、二硫化物異構(gòu)酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等，其中精氨酸激酶是昆蟲(chóng)能量代謝的關(guān)鍵酶，與白蟻的食物消化和生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)；另外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種高度特化的細(xì)胞器，涉及到細(xì)胞外膜蛋白和分泌蛋白的成熟，其中二硫鍵形成是關(guān)鍵的一步(Sevier and Kaiser,2002)，而白蟻腸道內(nèi)容物中的二硫化物異構(gòu)酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶都有氧化還原酶的作用，推測(cè)也參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊過(guò)程中半胱氨酸殘基的巰氫基的氧化連接(Sevier and Kaiser,2006;Schr?der,2008)，它們通過(guò)底物蛋白的巰基-二硫化物的交換機(jī)制轉(zhuǎn)移二硫鍵(Sevier and Kaiser,2006)，形成二硫鍵，而這個(gè)二硫鍵被直接轉(zhuǎn)移到分泌蛋白，參與分泌蛋白的結(jié)構(gòu)形成(Tu and Weissman,2004;Seoetal.,2015)。

迄今為止，人們?cè)诎紫伳c道共生微生物中獲得的外源纖維素酶基因已近千個(gè)，主要分屬糖基水解酶家族的第5家族、第7家族和第45家族(GH5,GH7和GH45)，并已在大腸桿菌Escherichiacoli中成功表達(dá)近百個(gè)，而白蟻內(nèi)源纖維素酶基因只有約20種得到克隆，屬于GH9，目前只有部分在原核表達(dá)成功的報(bào)道，所以白蟻的內(nèi)源性纖維素酶需要更深入地研究。本實(shí)驗(yàn)成功鑒定到了參與木質(zhì)纖維素降解和代謝相關(guān)的酶有5個(gè)，分別是2個(gè)白蟻內(nèi)源性纖維素酶[GH9家族內(nèi)切葡聚糖酶，(α/α)6結(jié)構(gòu)，來(lái)源于北美散白蟻R.flavipes]、1個(gè)白蟻內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶[GH9家族內(nèi)切葡聚糖酶，(α/α)6結(jié)構(gòu)，來(lái)源于山林原白蟻H.sjostedti]、1個(gè)GH11家族木聚糖酶[內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶，β-jelly roll結(jié)構(gòu))，由白蟻共生原生動(dòng)物產(chǎn)生的]、1個(gè)Cu-Zn SOD[(β-sandwich結(jié)構(gòu))，來(lái)源于雙翅目果蠅科花果蠅屬的Scaptodrosophilalebanonensis](圖3)，由于木質(zhì)素分解時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞色素的自由基，抗氧化酶可減少自由基，已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)木質(zhì)纖維素降解的預(yù)處理(Bruneetal.,1994)。而SOD可以保護(hù)中毒的白蟻消化道共生有機(jī)體的木質(zhì)素降解產(chǎn)物，因此，它或許可以保護(hù)由木質(zhì)素降解產(chǎn)生的氧化毒害。本實(shí)驗(yàn)的研究鑒定的酶都在白蟻的木質(zhì)纖維素降解中起非常重要的作用，因此，下一步可以對(duì)這些酶進(jìn)行分離純化或者結(jié)構(gòu)改造，提高酶的活性，應(yīng)用于木質(zhì)纖維素生物能源的高效降解。