Stathmin、P16、P63、Ki-67在宮頸上皮內瘤變中的表達及意義

張新東　趙甜甜　馬靜

[摘要] 目的 探討Stathmin、P16、P63、Ki-67在子宮頸鱗狀上皮內瘤變（CIN）中的表達及意義。 方法 收集2017年6月～2018年6月間在我院宮頸活檢及利普刀錐切標本396例，其中慢性宮頸炎標本74例作為對照組，CINⅠ級標本113例、CINⅡ級標本122例、CINⅢ級標本87例作為觀察組。采用免疫組化（IHC）檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67的表達情況。 結果 Stathmin蛋白在慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ的表達分別為5.41%（4/74）、15.93%（18/113）、38.53%（47/122）、88.51%（77/87），其中觀察組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。P16蛋白在對照組和觀察組的表達分別為12.16%（9/74）、85.84%（97/113）、100.00%（122/122）、100.00%（87/87），觀察組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。P63蛋白在對照組和觀察組的表達分別為6.76%（5/74）、66.37%（75/113）、97.54%（119/122）、100.00%（87/87），觀察組分別與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），Ki-67在對照組和觀察組的表達分別為24.32%（18/74）、75.22%（85/113）、100.00%（122/122）、100.00%（87/87），觀察組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。 結論 聯(lián)合檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67有助于鑒別宮頸的良性病變和宮頸上皮內瘤變，并可區(qū)分宮頸上皮內瘤變的低度病變和高度病變，以準確指導臨床治療。

[關鍵詞] Stathmin;P16;P63;Ki-67;宮頸鱗狀上皮內瘤變

[中圖分類號] R737.3 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）23-0140-05

Expression and significance of Stathmin， P16， P63， Ki-67 in cervical intraepithelial neoplasia

ZHANG Xindong ? ZHAO Tiantian ? MA Jing

Department of Pathology， Tengzhou Central People's Hospital in Shandong Province， Tengzhou ? 277500， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of Stathmin， P16， P63， Ki-67 in cervical squamous intraepithelial neoplasia（CIN）. ?Methods 396 cases of cervical biopsy and lip knife cone cutting specimens were collected in our hospital from June 2017 to June 2018， including 74 cases of chronic cervicitis specimens as a control group， 113 cases of CIN I grade specimens， 122 cases of CIN II grade specimens， 87 cases of CIN Ⅲ specimens were used as an observation group. Immunohistochemistry（IHC） was used to detect the expression of Stathmin， P16， P63 and Ki-67. Results The expression of Stathmin protein in chronic cervicitis， CINⅠ， CINⅡ， and CINⅢ was 5.41%（4/74）， 15.93%（18/113）， 38.53%（47/122）， and 88.51%（77/87）， and there were statistically significant differences between the observation group and control group（P<0.01）. There were statistically significant differences in the expression of P16 protein between the observation group[12.16%（9/74）] and the observation group[85.84%（97/113）， 100.00%（122/122）， and 100.00%（87/87）]（P<0.01）. There were statistically significant differences in the expression of P63 protein between the control group [6.76%（5/74）] and the observation group [66.37%（75/113）， 97.54%（119/122）， and 100.00%（87/87）， respectively]（P<0.01）. The expression of Ki-67 was 24.32%（18/74） in the control group， 75.22%（85/113）， 100.00%（122/122）， and 100.00%（87/87） in the observation group， and the difference between the two groups was statistically significant（P<0.01）. Conclusion The joint detection of Stathmin， P16， P63 and Ki-67 is helpful to identify benign cervical lesions and cervical intraepithelial neoplasia， and can distinguish between low-grade and high-grade cervical intraepithelial neoplasia to accurately guide clinical treatment.

[Key words] Stathmin; P16; P63; Ki-67; Cervical squamous intraepithelial neoplasia

子宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，是威脅女性健康和生命的主要惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率有所增加，且有年輕化趨勢。與宮頸浸潤癌密切相關的癌前病變的是宮頸鱗狀上皮內瘤變（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN），是與子宮頸癌有緊密聯(lián)系的一組癌前病變的統(tǒng)稱[1]，它包括了宮頸低級別鱗狀上皮內瘤變（Low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）和宮頸高級別鱗狀上皮內瘤變（High-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL），LSIL包括濕疣及CINⅠ，HSIL包括了CINⅡ和CINⅢ。LSIL大部分可自然消退，僅少數(shù)繼續(xù)可進展為HSIL和浸潤癌，而大部分HSIL具有癌變潛能，并且兩者的治療方案也完全不同，因此準確區(qū)分LSIL和HSIL具有至關重要的臨床意義。當宮頸上皮病變組織出現(xiàn)如反應性鱗狀上皮增生、基底細胞增生、不成熟鱗狀上皮化生、移行上皮化生和萎縮等情況時，病理醫(yī)師有可能受自身主觀因素的影響，在病理診斷結果上會有很大程度上的偏差，這時會致臨床漏診、誤診造成錯誤治療。因此，為了提高CIN診斷的準確性，使用有效的生物學標記物為組織病理學診斷提供客觀依據(jù)就顯得尤為重要[2-5]。本研究采用免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）方法聯(lián)合檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67在宮頸鱗狀上皮病變中的表達，探討其差異性及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集滕州市中心人民醫(yī)院病理科2017年6月～2018年6月間宮頸活檢及錐切標本396例，其中慢性宮頸炎標本74例作為對照組，年齡21～78歲，平均40.5歲。觀察組包括CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級，總共322例。CINⅠ級標本113例，年齡21～69歲，平均年齡38.1歲;CINⅡ級標本122例，年齡24～70歲，平均39.7歲;CINⅢ級標本87例，年齡25～66歲，平均44.1歲。所有的病理切片均由兩名高年資病理醫(yī)師共同閱片確診。各組年齡比較均無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05），具有可比性。本研究所涉及的相關病理檢測符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 方法

396例宮頸活檢及錐切標本均經(jīng)10%中性甲醛固定，全自動脫水機（Leica ASP300S）脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光鏡觀察。采用全自動免疫組化染色機（LEICA BOND-MAX）進行免疫組化檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67的表達，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗做陰性對照染色。

1.3 試劑

兔抗人Stathmin單克隆抗體（克隆號：SP49）、鼠抗人P16單克隆抗體（克隆號：MX007）、鼠抗人P63單克隆抗體（克隆號：MX008）、鼠抗人Ki-67單克隆抗體（克隆號：MX006），以上試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.4 免疫組化結果判定[6]

陽性結果判定標準：用光學顯微鏡觀察顯色反應，在高倍鏡下（×400）對每一張切片隨機選擇具有代表性的5個視野， 并且每個視野計數(shù)100個細胞，總共計數(shù)500個細胞，然后計算每張切片陽性細胞數(shù)所占的百分比。（1）Stathmin以細胞質內見到棕黃色顆粒為陽性。（2）P16以細胞核或細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。（3）P63以細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒陽性。（4）Ki-67以細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒陽性。（5）按照陽性細胞百分比的多少分4級：無陽性細胞（-）為0～10%，弱陽性（+）為10%～25%，中度陽性（++），25%50%，>50%強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad 6.0軟件對所有數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學分析，陽性率值計算為各組陽性表達例數(shù)比總例數(shù)的值，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Stathmin、P16、P63、Ki-67在各組子宮頸病變標本中的表達情況

統(tǒng)計結果所示，Stathmin、P16、P63、Ki-67蛋白在慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級和CINⅢ級組織中的陽性率表達是逐漸增高的，并且三組觀察組的陽性率都高于對照組。見表1。

2.2 Stathmin蛋白表達在各組間比較

Stathmin的表達定位在細胞質（封三圖9）;結果顯示Stathmin在慢性宮頸炎組的陽性表達率明顯低于三組觀察組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;CINⅠ級組陽性表達率明顯低于CINⅡ級組和CINⅢ級組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 P16蛋白表達在各組間比較

P16蛋白的表達定位在細胞核或細胞質（封三圖10）;結果顯示P16在慢性宮頸炎組的陽性表達率明顯低于三組觀察組，差異有統(tǒng)計學意義;CINⅠ級組陽性表達率明顯低于CINⅡ級組和CINⅢ級組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 P63蛋白表達在各組間比較

P63蛋白的表達定位在細胞核（封三圖11）;結果顯示P63在慢性宮頸炎組的陽性表達率明顯低于三組觀察組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;CINⅠ級組陽性表達率明顯低于CINⅡ級組和CINⅢ級組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

2.5 Ki-67蛋白表達在各組間比較

Ki-67蛋白的表達定位在細胞核（封三圖12）;結果顯示Ki-67在慢性宮頸炎組的陽性表達率明顯低于三組觀察組，結果有統(tǒng)計學意義;CINⅠ級組陽性表達率明顯低于CINⅡ級組和CINⅢ級組，差異結果有統(tǒng)計學意義。見表5。

3 討論

CIN是宮頸癌發(fā)生的黃金階段，在篩查宮頸上皮病變時，如何利用有效的客觀指標來評價各級CIN也是病理醫(yī)師的診斷難點。CIN分級不同，它的治療和預后也有很大的差異，因此為了明確鑒別CIN級別需借助免疫組織化學標記物來輔助診斷。病理日常工作中常用的抗體是P16、Ki-67，但這兩種抗體標記對CIN的診斷仍存在一定的偏差，不可避免出現(xiàn)漏診和誤診。而本研究通過聯(lián)合檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67有助于明確CIN級別和提高診斷準確率，最大程度減少了漏診和誤診。

Stathmin是一種相對分子量為19 KD的蛋白質，廣泛存在于細胞質中。它是一種微管相關蛋白（Microtubule associated protein，MAPs），由于其作用可以促進微管的解聚，參與細胞生長和細胞周期的調節(jié)，引起細胞生物學行為變化，具有癌蛋白的功能[7]，在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及表型決定上的重要作用及意義，可在多種腫瘤中呈高表達。有研究表明，Stathmin在所有的子宮頸癌和CINⅢ級都是過表達，而在低級別病變中不表達或部分表達。Brooke等研究證實Stathmin在宮頸上皮內瘤變高表達，且與病變級別相關[8]。本研究中發(fā)現(xiàn)Stathmin蛋白在LSIL組和HSIL組差異有統(tǒng)計學意義，CIN組織中Stathmin與P16蛋白表達有正相關性，與Howiitt BE等[9]的報道一致。所以Stathmin協(xié)同P16檢測可提高宮頸上皮內病變的分級準確率。

P16是一種重要的抑癌基因，它位于人類染色體9P21，它參與了細胞周期的調控。P16蛋白通過抑制細胞周期依賴性蛋白激酶4（Cdk4）的活性，阻止細胞進入S期。它一旦失活會導致惡性增殖，在判斷良性宮頸病變、CIN中有十分重要的臨床意義[10]。國內外研究表明，P16是檢測子宮頸癌前病變的一個有效指標，許多實驗也支持P16在宮頸HSIL中的診斷價值[11，12]，但P16一般與具有人乳頭瘤病毒（HPV）感染所致的CIN病變有更為密切的關系，用P16來代替高危HPV檢測的敏感性和特異性達到80%以上[13-15]。P16的表達隨著宮頸病變的級別上升而表達強度增強，是宮頸上皮內瘤變病理診斷的很好的補充[16]。本研究結果顯示，CIN組中P16陽性表達率明顯高于正常對照組，P16在宮頸CINⅡ及CINⅢ組陽性表達率明顯高于宮頸CINⅠ組，表明P16可以有效提高對早期宮頸病變進展的預測效果，從而可以對這部分患者進行密切監(jiān)測及早期干預治療。

P63是近年來發(fā)現(xiàn)的P53基因家族新成員，定位于染色體3q27～3q28，是一種核蛋白，與抑癌基因P53具有同源性的基因編碼，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及細胞凋亡過程。陳瑋等[17]研究證實P63在正常子宮頸鱗狀上皮呈陰性表達，鱗狀上皮增生可呈陽性表達，P63陽性表達強度隨CIN級別增高而顯著升高。本研究結果顯示，P63在CIN表達陽性率高于正常組織，提示P63隨著宮頸病變的進展其陽性表達率顯著上升，與大多數(shù)文獻報道相同[18]。

Ki-67是目前較為肯定的核增殖標志物，存在于細胞周期中除G0期以外的所有階段。Ki-67蛋白在鑒別慢性宮頸炎、高低級別CIN及宮頸癌中有較大的意義，研究認為Ki-67蛋白與宮頸病變的嚴重程度相關，可作為鑒別診斷的指標[19]。徐濤等[20]研究結果發(fā)現(xiàn)，在CIN組中陽性率隨CIN級別升高而升高，在宮頸癌組織中的表達最強。Lorenzato M等[21]研究顯示子宮頸上皮的上2/3發(fā)現(xiàn)Ki-67陽性表達可作為鑒別LSIL、HSIL的標志。本研究顯示，Ki-67陽性表達在慢性宮頸炎及CIN中差異顯著，且陽性程度隨CIN級別的升高而升高，提示宮頸上皮病變的過程是細胞增殖逐漸活躍的過程，Ki-67陽性表達程度對CIN分級的診斷有提示作用。但由于Ki-67存在于增殖的細胞中，部分炎性疾病和CINⅠ級宮頸組織中的也可見Ki-67陽性表達，因此在鑒別子宮頸上皮內瘤變時最好與其它指標聯(lián)合，國內經(jīng)常把P16、Ki-67聯(lián)合使用，作為判斷子宮頸良性病變與CIN的客觀指標。崔凱等[22]研究顯示，檢測p16蛋白及Ki-67抗原的表達對CIN的分級診斷具有較高的價值。

綜上所述，CIN是多基因、多因素共同作用的結果，準確、客觀地診斷CIN及其分級對臨床進一步治療和預后評價是非常重要的。盡管區(qū)分LSIL和HSIL非常重要，但組織形態(tài)學上兩者是連續(xù)的病變，并沒有一個截然的分界線，本研究結果顯示，聯(lián)合檢測Stathmin、P16、P63和Ki-67，可以區(qū)分HSIL與LSIL和良性反應性改變，在一定程度上盡可能的避免不同病理醫(yī)師對CIN進行診斷時出現(xiàn)可重復性差的問題，使CIN分級更加精確，使診斷更加客觀，為臨床治療提供確實有效的病理診斷依據(jù)，減少了誤診造成的錯誤治療，有效減輕了患者的精神及經(jīng)濟負擔，對有效預防子宮頸癌的發(fā)生和早期治療具有重要意義。

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（收稿日期：2020-04-08）