林婧楠，徐黎明，趙景壯，任廣明，盧彤巖

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070)

SVCV是一種有類脂囊膜的彈狀病毒，長為90～180 nm，寬為60～90 nm，隸屬單股負(fù)鏈RNA病毒目彈狀病毒科Rhabdoriridae水泡性病毒屬Vesiculorius[1]。SVCV的基因組全長約為11 000 bp，共包含5個(gè)主要的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORFs)，分別編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，即核蛋白(Nuclear protein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(Matrix protein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)和RNA聚合酶(RNA polymerase，L)，各結(jié)構(gòu)蛋白之間的連接順序?yàn)?′-N-P-M-G-L-5′[4]。目前GenBank中共收錄16株SVCV的全基因組序列，其中11株來自中國。Stone等[5]于2003年對來自不同國家的15株SVCV分離株部分G蛋白的基因序列(550 bp)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，將世界范圍內(nèi)的SVCV分成Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd 4個(gè)基因型。此后，編碼G蛋白的基因序列成為劃分SVCV基因型的主要參考基因序列。目前，國內(nèi)有3株SVCV分離株(SVCV-A1、SVCV-265、BJ0505-2)完成了全基因組序列生物學(xué)分析工作[6-8]。

本課題組在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測期間，獲得一株中國北方地區(qū)現(xiàn)行毒株SVCV-shlj4[9]。為了更好地了解該毒株的分子特征，本研究中通過分段克隆、測序、拼接，獲得了該毒株的全基因組序列，結(jié)合生物信息學(xué)研究方法對該基因組序列及其編碼M蛋白、G蛋白、P蛋白的基因序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育和基因型分析，旨在明確中國北方地區(qū)SVCV分離株與國內(nèi)乃至世界各地SVCV毒株間的進(jìn)化關(guān)系，為揭示SVCV分子進(jìn)化機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鯉上皮瘤細(xì)胞(Epithelioma papulosum cyprini，EPC)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所曾令兵研究員惠贈(zèng)；SVCV-shlj4毒株由本課題組在2016年黑龍江地區(qū)養(yǎng)殖鯉流行病調(diào)查中分離保存。

大腸桿菌(E.coli)DH5α、pMD18-T克隆載體、PCR純化試劑盒、RACE試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Easy-A High Fidelity Cloning Enzyme購自Stratagene公司；MEM(Minimum essential medium)細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶購自Hyclone生物公司；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)購自Gibco生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的SVCV-A2基因組序列(NCBI登錄號：DQ491000.1)，利用Primer Premier 5.1軟件設(shè)計(jì)特異性引物。將SVCV-shlj4毒株全基因組編碼區(qū)分成3個(gè)部分，分別命名為1st、2nd、3rd，為保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，相鄰的擴(kuò)增片段之間含有部分重疊區(qū)域。3對重疊引物分別為

1st F：5′ATGAGTGTCATTCGGATCAAAACAA 3′，

1st R：5′TTCAGCTGCATGGCAGATCCATCCA 3′；

教師是能否成功實(shí)施翻轉(zhuǎn)課堂的關(guān)鍵，對教改中遇到挑戰(zhàn)和困難，教師必須進(jìn)行認(rèn)真的思考和積極的探索。本文針對通信電子電路翻轉(zhuǎn)課堂中存在的問題，總結(jié)出了以下的應(yīng)對策略。

2nd F：5′TACACGGAAATCTACCTAACACA 3′，

2nd R：5′TCATCATTGTTGATGATTAATCCTAG 3′；

3rd F：5′ACACAGTTGTAAAAGTGTTGGCT 3′，

3rd R：5′CTATTCTACCCATGTCCCAGAGT 3′。

根據(jù)已獲得SVCV-shlj4毒株的CDS序列信息，利用RACE試劑盒，設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增5′末端和3′末端非編碼區(qū)的上、下游引物，分別為

5′RACE：GTTAGCCGGAAGCACGGCAGCAACT，

3′RACE：TCGGTACCAACAGTGTCTTCCGCTC。

以上引物由長春庫美生物公司合成。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆及測序 采用Trizol法對SVCV-shlj4毒株進(jìn)行總RNA的提取[10-11]。以提取的總RNA作為模板，利用Easy-A高保真DNA聚合酶，對SVCV株 3段基因序列進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增及3′末端加A處理。利用PCR純化試劑盒對擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物回收。將回收后的產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，在含有氨芐青霉素抗性的LB平板中培養(yǎng)，直至長出單菌落。每個(gè)連接選擇3個(gè)陽性克隆并送至庫美公司測序，以得到SVCV-shlj4毒株的編碼區(qū)基因序列。利用RACE試劑盒，結(jié)合已獲得的編碼區(qū)基因序列，繼續(xù)擴(kuò)增SVCV-shlj4分離株5′末端和3′末端非編碼區(qū)，對其進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序，操作方法同上。

1.2.3 SVCV-shlj4毒株系統(tǒng)發(fā)育分析 利用DNAsis軟件對該毒株的3段基因序列及5′末端和3′末端非編碼區(qū)的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，結(jié)合Lasergene(DNAStar，Inc.，USA)、Clustal W及MEGA 5.1生物信息學(xué)軟件，對SVCV-shlj4毒株基因組及GenBank中檢索得到的其他16株SVCV基因組序列進(jìn)行同源性分析并繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。同時(shí)，利用MEGA 5.1軟件和Lasergene對SVCV-shlj4分離株及其他SVCV參考毒株編碼的M蛋白、P蛋白、G蛋白基因序列進(jìn)行多重對比，采用Neighbor-Joining法(1000 runs)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 SVCV-shlj4毒株基因組特征

SVCV-shlj4毒株基因組全長為11 029 bp，已提交至GenBank( NCBI登錄號：MT675953)。該基因組共由5個(gè)開放閱讀框構(gòu)成，從3′端到5′端共編碼5 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，各結(jié)構(gòu)蛋白之間的連接順序?yàn)?3′-N-P-M-G-L-5′(表1)。N基因全長為1335 bp，開放閱讀框長度為1257 bp，編碼蛋白418 aa，蛋白相對分子量約為47 000；P基因全長為967 bp，開放閱讀框長度為930 bp，編碼蛋白309 aa，蛋白相對分子量約為36 000；M基因全長為716 bp，開放閱讀框長度為672 bp，編碼蛋白223 aa，蛋白相對分子量約為26 000；G基因全長為1598 bp，開放閱讀框長度為1530 bp，編碼蛋白約509 aa，蛋白相對分子量約為57 000；L基因全長為6325 bp，開放閱讀框長度為6288 bp，編碼蛋白2095 aa，蛋白相對分子量約為121 000。

表1 開放閱讀框信息Tab.1 Information on the open reading frame

SVCV-shlj4毒株的N基因、M基因、G基因、L基因均由AACAGACATC(ATG)作為轉(zhuǎn)錄起始信號，而P基因的轉(zhuǎn)錄起始信號序列為AACAGAGATC(ATG)，有一個(gè)堿基發(fā)生突變，各基因序列均以TATG(A)7作為轉(zhuǎn)錄終止信號。此外，毒株各基因的連接區(qū)高度保守，其中N基因、P基因、M基因及G基因之間的連接區(qū)均為CT，G基因和L基因之間的連接區(qū)為CTAT。SVCV-shlj4毒株基因組的3′ 端非編碼區(qū)(1 nt～8 nt)與5′ 端非編碼區(qū)(11029 nt～11022 nt)存在8對反向互補(bǔ)序列(ACGAAGAC)(圖1)。

2.2 SVCV基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MEGA 5.1軟件，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)通過自舉分析(Bootstrap 1000 runs)構(gòu)建包括SVCV-shlj4在內(nèi)的17株SVCV全基因組的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，各參考毒株具體的信息如表2所示。進(jìn)化分析結(jié)果顯示：SVCV-shlj4毒株與中國內(nèi)地株(10株)、中國香港株(1株)及韓國株(3株)聚為一簇，同屬亞洲分支，一致性在97.1%～99.0%，與SVCV-A2毒株一致性最高(99.0%)，與SVCV-202238毒株一致性較低(97.1%)；Fijan株和VR-1390株屬于歐洲分支，SVCV-shlj4株與二者在進(jìn)化上有明顯差異，一致性最低(93.0%)(圖2)。

表2 本研究所用SVCV基因組序列Tab.2 The SVCV genome sequence used in this study

2.3 編碼M、G、P蛋白的基因系統(tǒng)發(fā)育分析

利用BLAST檢索(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)獲得其他SVCV參考株編碼M、G、P蛋白的基因序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：根據(jù)編碼M蛋白的核苷酸序列可將SVCV分為兩大分支，亞洲分支和歐洲分支，其中亞洲分支包括中國所有毒株、韓國株ADC-SVC2016-1和美國株(207914、266921、316715、212364及322383)(圖3)；根據(jù)編碼G蛋白的核苷酸序列可將SVCV分為4個(gè)基因型，分別為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd，其中，SVCV-shlj4毒株的基因型為Ⅰa，與中國株SVCV-265可能來源于同一祖先，聚為一簇(圖4)；根據(jù)編碼P蛋白的核苷酸序列可進(jìn)一步將Ⅰa基因型劃分成Ⅰai和Ⅰaii兩個(gè)基因亞型，SVCV-shlj4株與中國株BJ0505-2、SVCV-A1、SVCV-A2及美國株OM-24聚為一簇，均為Ⅰaii基因亞型，其中與SVCV-A2株的一致性最高(99.0%)(圖5)。

2.4 各基因序列變異位點(diǎn)分析

SVCV-shlj4毒株各基因序列變異位點(diǎn)的分析結(jié)果顯示(圖6)：與中國株SVCV-A1相比，SVCV-shlj4毒株在N基因編碼區(qū)第1357、1364和1376 nt分別缺失1個(gè)堿基，在G基因3′端非編碼區(qū)4630 nt處和4639 nt處缺失兩段基因序列(分別為44 bp和31 bp)；與歐洲株VR-1390相比，SVCV-shlj4毒株在G基因3′端非編碼區(qū)(4637 nt位點(diǎn))插入一段10 bp的基因片段；與中國株BJ0505-2相比，SVCV-shlj4毒株在L基因編碼區(qū)(5822 nt位點(diǎn))缺失一段18 bp的基因片段，該基因缺失導(dǎo)致L基因編碼區(qū)缺失6個(gè)氨基酸(序列為KSLANA)(圖7)。

3 討論

SVC首次被報(bào)道是在20世紀(jì)70年代，F(xiàn)ijan[12]從患病的魚體中分離得到SVCV。該病毒嚴(yán)重威脅到歐洲鯉魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，并對其造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中國對于SVCV的報(bào)道是在2002—2004年間，劉葒等[3，13]在對全國范圍內(nèi)SVCV監(jiān)控過程中，首次分離報(bào)道了該病毒。近年來，該病在中國雖然沒有大規(guī)模的暴發(fā)，但在多個(gè)地區(qū)均有關(guān)于SVCV分離鑒定的報(bào)道，這應(yīng)當(dāng)引起國內(nèi)鯉科魚類養(yǎng)殖業(yè)的高度重視。

3.1 參考毒株的選擇及基因組結(jié)構(gòu)分析

由GenBank SVCV分離株的收錄情況可知，迄今為止，國際上共完成了16株SVCV毒株基因組序列的測定工作，其中11株為中國株。本課題組在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測期間，分離獲得了一株中國北方地區(qū)現(xiàn)行毒株SVCV-shlj4。根據(jù)OIE檢測標(biāo)準(zhǔn)對該病毒進(jìn)行鑒定，RT-PCR產(chǎn)物測序結(jié)果對比顯示，SVCV-shlj4與中國株SVCV-A2的核酸一致性最高。因此，本研究中選用SVCV-A2作為參考毒株設(shè)計(jì)引物，以獲得SVCV-shlj4全基因組序列。測序結(jié)果顯示，該毒株的基因組大小為11 029 bp，共編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，各基因之間的連接區(qū)高度保守，N基因、P基因、M基因及G基因連接區(qū)均為CT，G基因與L基因連接區(qū)為CTAT，這些基因間連接區(qū)與其他水泡病毒屬成員一致，區(qū)別于彈狀病毒科的其他屬成員[14]。同時(shí)，SVCV-shlj4毒株基因組的3′ UTR與5′ UTR存在8對反向互補(bǔ)序列，這是彈狀病毒基因組和不分段負(fù)鏈RNA病毒的共同特征[15]。

3.2 全基因組及編碼M、G、P蛋白的基因系統(tǒng)發(fā)育分析

在得到SVCV-shlj4毒株全基因組序列后，將其與其他16株SVCV參考株全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，SVCV基因組序列相對穩(wěn)定，但不同地區(qū)的毒株存在一定的差異，一致性為93.0%～99.0%。通過對比SVCV參考株編碼M、G、P蛋白的基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，可以發(fā)現(xiàn)，編碼M蛋白的核苷酸序列可將SVCV分為兩大分支，亞洲或亞洲原始分支及歐洲分支[16]。亞洲SVCV分離株(包括韓國株和中國株)均處于同一分支，各毒株間核苷酸一致性較高，亞洲原始株包括美國株207914、266921、316715、212364、322383[16]，其中SVCV-shlj4株與美國株322383的一致性最高(99.7%)，說明二者可能來源于同一祖先。根據(jù)編碼G蛋白的部分核苷酸序列可將SVCV分為4種基因型，分別為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd，其中，Ⅰa基因型包括亞洲株和亞洲原始株，Ⅰb和Ⅰc基因型包括來自摩爾多瓦、烏克蘭和俄羅斯等國家的分離株，Ⅰd基因型包含來自英國和其他歐洲國家的分離株。目前，中國SVCV分離株均為Ⅰa基因型[3]。由于編碼P蛋白的基因系統(tǒng)發(fā)育樹與編碼G蛋白的基因拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似[6]，可將Ⅰa基因型進(jìn)一步分為Ⅰai和Ⅰaii兩個(gè)基因亞型，SVCV-shlj4與中國株A1、A2、BJ0505-2及美國株OM-24聚為一簇，均為Ⅰaii基因亞型，印證了之前關(guān)于美國毒株由亞洲傳入的假說[8,17]。

3.3 各基因變異位點(diǎn)分析

在對比分析各個(gè)參考毒株和SVCV-shlj4毒株各基因核苷酸變異位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，SVCV-shlj4毒株與中國株SVCV-A1、BJ0505-2、歐洲株VR-1390在N基因、G基因及L基因存在明顯差異。其中，SVCV-shlj4毒株與中國株SVCV-A1差異性主要存在于N蛋白的編碼區(qū)和G蛋白的3′端非編碼區(qū)；與中國株BJ0505-2的差異性主要存在于L蛋白的編碼區(qū)；與歐洲株VR-1390株的差異性主要存在于G蛋白的3′端非編碼區(qū)。這些差異性可能是導(dǎo)致各個(gè)地區(qū)毒株毒力強(qiáng)弱的主要原因之一。

綜上所述，SVCV-shlj4毒株在進(jìn)化上屬于亞洲分支，屬Ⅰa基因型，Ⅰaii基因亞型。雖然當(dāng)前國內(nèi)SVCV基因型均為Ⅰa，但來源于不同地區(qū)SVCV分離株的核酸序列依然存在一定差異，SVCV毒株在中國不同地區(qū)不同環(huán)境中正在不斷地進(jìn)化。本研究結(jié)果可為SVCV分子進(jìn)化研究提供數(shù)據(jù)支撐。