曹麗萍， 杜金梁， 賈睿，丁煒東，Jeney Galina，徐跑，殷國俊*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類免疫藥理學(xué)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081； 3.Research Institute for Fisheries,Aquaculture and Irrigation,Ann light 8,Szarvas H-4440,Hungary)

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，然而高養(yǎng)殖密度，高蛋白、高脂肪飼料的頻繁使用，抗病藥物的濫用等使得養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，魚類病害較為嚴(yán)重[1]。肝臟作為魚體最大的代謝器官，在魚類消化、排泄、解毒及免疫等多種生命活動中發(fā)揮重要作用，但其易受到各種毒物、病原累及[2-3]，導(dǎo)致肝組織受損，進(jìn)而引起代謝紊亂誘發(fā)細(xì)菌和病毒感染，甚至導(dǎo)致魚類死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。大量研究發(fā)現(xiàn)，許多中草藥及其提取物都具有顯著的保肝作用[4]，其作用機(jī)理顯示主要與中藥的清除氧自由基、抗氧化、抑制細(xì)胞色素P450酶系CYP450[5-6]及抑制NF-κB活性有關(guān)[7]。CYP450酶分布于多種組織和器官中，其中肝臟中含量最為豐富，可參與體內(nèi)外多種化合物代謝，在肝損傷發(fā)生過程中起到了十分重要的作用。研究證明，在經(jīng)典的CCl4誘導(dǎo)肝損傷模型中，CCl4通過CYP450作用代謝為三氯甲烷自由基(CCl3·)進(jìn)而引起膜脂質(zhì)過氧化，這是造成肝損傷的一個重要原因[8]。

大黃素(emodin, EMD),作為虎杖、大黃等傳統(tǒng)中藥的有效單體成分，在臨床和生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用。大黃素具有顯著的抗炎、抗腫瘤、抗肝纖維化作用[9]。大黃素的肝保護(hù)作用主要與抑制肝臟炎癥、抑制肝星形細(xì)胞的增殖活化及調(diào)節(jié)促纖維化因子表達(dá)等方面有關(guān)[10]。目前，大黃素對魚類肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)理研究尚未見報(bào)道，為了闡明大黃素在魚類上的保肝作用，本研究中以CCl4誘導(dǎo)建鯉CyprinuscarpioJian肝損傷，并建立在體肝損傷模型，探討大黃素的肝保護(hù)作用及對肝細(xì)胞色素酶的影響，以期為保肝藥物開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用建鯉由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心漁場提供，健康無傷，規(guī)格齊整，飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中(每個缸體積為240 L)，飼養(yǎng)條件溫度為(27±2)℃，pH為6.8～7.6，DO>5 mg/L，總氨氮<0.05 mg/L，H2S<0.01 mg/L。每天投喂量為魚體質(zhì)量的2%，馴養(yǎng)1周。

藥品與試劑:CCl4(分析純)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，配制成30%的CCl4-橄欖油溶液(CCl4∶橄欖油=3∶7)；大黃素標(biāo)準(zhǔn)品購自美國SIGMA公司(St.Louis，Missourk， USA)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)購于上海嚴(yán)謹(jǐn)科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)、白蛋白(Alb)、總蛋白(TP)、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的制備 基礎(chǔ)飼料包括面粉17.4%、魚粉6.0%、菜籽粕27.0%、米糠粕10.0%、棉籽粕10.0%、豆粕24.0%、磷脂1.0%、豆油1.0%、磷酸二氫鈣1.5%、氯化膽堿0.1%、維生素預(yù)混料1.0%、礦物質(zhì)預(yù)混料1.0%。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.1%、0.3%、0.5%的大黃素，同時減少等量面粉，配制成3種試驗(yàn)飼料，試驗(yàn)飼料營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Ingredients and nutrient levels of experimental diets w/%

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 將初始體質(zhì)量為150 g左右的健康建鯉隨機(jī)分為5組，每組20尾，分別為空白對照組、模型對照組(CCl4)、低劑量藥物組(1 g/kg EMD)、中劑量藥物組(3 g/kg EMD)和高劑量藥物組(5 g/kg EMD)，每組設(shè)2個平行，每個平行10尾，放在10個缸中飼養(yǎng)。其中，空白和模型組均投喂基礎(chǔ)飼料，低、中、高劑量藥物組分別投喂含1、3、5 g/kg大黃素的試驗(yàn)飼料。每天投喂2次，記錄投喂餌料量,每次投喂量為魚體質(zhì)量的2%，共養(yǎng)殖60 d。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，給空白組魚腹腔注射等量橄欖油, CCl4組和中藥組腹腔注射30%的CCl4, 注射劑量為0.05 mL/10 g魚體，禁食72 h，以誘導(dǎo)肝損傷。整個養(yǎng)殖及試驗(yàn)過程中建鯉死亡率為0。

用MS-222麻醉魚后，對各組魚稱重、采集血液與肝組織，每組20個樣品均進(jìn)行測定。

1.2.3 大黃素抗氧化活性分析 采用DPPH法測定藥物的抗氧化能力[11]。將DPPH用無水乙醇充分溶解后，配制成濃度為2×10-4mol/L的溶液。將大黃素配制成0、1、2、3、4、5、6 μg/mL水溶液。取2 mL DPPH乙醇溶液,加入2 mL不同濃度的大黃素溶液，混勻后避光靜置30 min，在517 nm下測定每個大黃素溶液的吸光值。DPPH的抑制率與清除自由基的能力成正比，其計(jì)算公式為

抑制率=(A1-A2)/A×100%。

(1)

其中：A為2 mL DPHH溶液與2 mL無水乙醇混合后在517 nm處的吸光度；A1為2 mL DPHH溶液與2 mL大黃素溶液混合后在517 nm處的吸光度；A2為2 mL 大黃素溶液與2 mL無水乙醇混合后在517 nm處的吸光度。

1.2.4 生長指標(biāo)的測定與計(jì)算 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算出每組魚的相對增重率(RWR,%)、特定生長率(SGR,%/d)、餌料系數(shù)(FCR)和肝指數(shù)(LI,%)，計(jì)算公式為

RWR=(Wt-W0)/W0×100%，

(2)

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%，

(3)

FCR=F/(Wt-W0)，

(4)

LI=WL/Wt×100%。

(5)

其中：Wt、W0分別為試驗(yàn)終末和初始魚的體質(zhì)量(g)；t為飼喂時間(d)；F為投喂飼料量(g)；WL為肝臟質(zhì)量(g)。

1.2.5 血清和肝組織生化指標(biāo)的測定 用CCl4注射建鯉72 h后，采用一次性注射器,從試驗(yàn)魚尾靜脈采血，血樣于4 ℃下靜置2 h后以3000 r/min離心15 min，分離血清，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。按照試劑盒操作說明分別測定血清中相關(guān)生化指標(biāo)。

對采血后的魚進(jìn)行解剖，在肝臟右中葉相同部位取肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗血液，剪去肝臟表面附著的結(jié)締組織，再用濾紙吸去表面水分后稱重并剪碎，移入勻漿管中，加入9 倍體積的生理鹽水 (體積分?jǐn)?shù)為0.86%) 進(jìn)行勻漿。該勻漿以2000 r/min 離心15 min，收集上清備用。按照試劑盒操作說明分別測定肝勻漿中各項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.2.6 肝微粒體中CYP450酶含量的測定 采用差速離心法獲取建鯉肝微粒體[12]。建鯉采凈血液后迅速取出肝臟，用濾紙吸凈表面水分后稱重并剪碎，用KCl-磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.4)漂洗3次，洗凈血水。每克肝臟加入3 mL 的KCl-磷酸緩沖液，在冰上制備勻漿。肝勻漿于4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，棄沉淀。上清液再于4 ℃下以25 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀部分即為肝微粒體。向肝微粒體中加入含30%甘油的KCl-Tris-HCl 緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.4)，吹打懸浮后分裝于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存。肝微粒蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測定[13]。

取0.5 mL肝微粒體懸液(0.5 g/L)與適量連二亞硫酸鈉混合，平均分成兩份，加入比色杯中并用一氧化碳充氣約30 s。在450 nm和490 nm處測定樣品吸光度，計(jì)算CYP450含量[14]：

CYP450含量(nmol/mg)=(A450 nm-A490 nm)×1000 /[91×蛋白濃度(g/L)]。

(6)

1.2.7 肝組織中CYP1A、CYP3AmRNA的表達(dá)檢測 將建鯉處死后，迅速獲取適量肝組織置于液氮中儲存。按照RNAiso Reagent試劑盒操作抽提總RNA。用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度及純度, 當(dāng)A260 nm/A280 nm值達(dá)到1.8～2.0 時可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以O(shè)ligo (dT)18為引物進(jìn)行RT反應(yīng)合成cDNA。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)按照TaKaRa 公司生產(chǎn)的ExScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time: SYBR Green I) 進(jìn)行。基因特異引物及內(nèi)參β-actin引物分別按照建鯉CYP1A、CYP3A和β-actin基因序列采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)。用2ΔΔCT法對目的基因表達(dá)進(jìn)行相對定量分析[15]。引物如下：

CYP1A-F： 5′TGACAAGGACAACATCCGAGAC 3′，

CYP1A-R： 5′ATAGACGACAGCCCAAGACAGAG 3′；

CYP3A-F： 5′CACCGCTTTATTTCCTTTCATC 3′，

CYP3A-R： 5′CTCGCTTCTTCTTGTGGCCT 3′；

β-actin-F： 5′GTCAAGTCCGTTGAGATGCACC 3′，

β-actin-R： 5′GGATGATGACCTGAGCATTGAAGC 3′。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 15軟件進(jìn)行單因素方差分析(One way-ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃素清除自由基的能力

從圖1可見：大黃素濃度較低時，清除DPHH能力近似線性關(guān)系，大黃素濃度為3 μg/mL時，其清除能力達(dá)到65%；隨著大黃素濃度的增加，大黃素清除DPPH自由基的能力漸趨平緩，大黃素濃度為6 μg/mL時，其清除自由基能力達(dá)到81%。

2.2 建鯉生長指標(biāo)的變化

試驗(yàn)組飼喂不同濃度的大黃素飼料60 d，在注射CCl4造模前，對建鯉生長指標(biāo)進(jìn)行了測定。從表2可見：與空白對照組相比，飼喂含3、5 g/kg大黃素飼料能顯著提高建鯉的終體質(zhì)量、相對增重率和特定生長率(P<0.05)，顯著降低餌料系數(shù)(P<0.05)，且這種影響隨著大黃素含量的升高，效果愈加明顯；模型組與空白組均飼喂基礎(chǔ)飼料，兩組建鯉生長指標(biāo)無顯著性差異(P>0.05)。

表2 大黃素對建鯉生長指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of EMD on growth index of common carp

2.3 建鯉血清中生化指標(biāo)的變化

從表3可見: CCl4作用建鯉72 h 后，與空白對照組相比，模型組血清中的GOT、GPT 和LDH 活性均顯著升高(P<0.05)，Alb和TP含量顯著下降(P<0.05); 而3、5 g/kg大黃素能顯著抑制CCl4誘導(dǎo)GOT水平升高，5 g/kg大黃素能顯著抑制CCl4誘導(dǎo)GPT 和LDH水平的升高(P<0.05)，同時也能顯著恢復(fù)血清中Alb和TP含量(除1 g/kg大黃素組外)(P<0.05)，且隨著用藥劑量的提高，其作用愈加明顯。

表3 大黃素對建鯉血清生化指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of EMD on biochemical indices in serum of common carp

2.4 肝組織中抗氧化指標(biāo)、肝微粒體中CYP450酶及肝指數(shù)的變化

從表4可見：CCl4作用建鯉72 h后，與空白對照組相比，模型組肝組織中T-AOC和SOD活性均顯著下降(P<0.05)，GSH-Px和GSH消耗明顯，MDA大量生成(P<0.05);3、5 g/kg大黃素能顯著防止肝組織中T-AOC、SOD、GSH-Px及GSH水平下降并顯著抑制MDA生成(P<0.05)，且隨著大黃素劑量升高，其作用愈加顯著。

從表4還可見：CCl4作用建鯉72 h后，與空白對照組相比，模型組肝微粒體中CYP450酶含量顯著增加(P<0.05)，表明CCl4對CYP450酶有誘導(dǎo)作用，而3、5 g/kg大黃素飼料組建鯉肝微粒體中CYP450酶含量顯著降低(P<0.05)，這表明大黃素能抑制CCl4對CYP450酶的誘導(dǎo)，且中、高劑量大黃素抑制效果優(yōu)于低劑量，即大黃素對CYP450酶的抑制作用有劑量依賴性；同時，CCl4誘導(dǎo)建鯉肝損傷后，引起肝組織腫大，CCl4組建鯉肝指數(shù)較空白對照組顯著增大(P<0.05)，而3、5 g/kg大黃素能顯著抑制CCl4導(dǎo)致的建鯉肝組織腫大，肝指數(shù)明顯降低，且隨著大黃素劑量的升高，恢復(fù)效果愈加顯著(P<0.05)。

表4 大黃素對建鯉肝組織中抗氧化指標(biāo)和肝微粒體中CYP450酶含量及肝指數(shù)的影響Tab.4 Effects of EMD on antioxidant ability in the liver, and CYP450 enzyme content in liver microsomes and hepato-somatic index of common carp

2.5 肝組織中CYP3A、CYP1A基因表達(dá)量的變化

從圖2可見：CCl4腹腔注射建鯉72 h后，模型組肝組織中CYP3A和CYP1A的mRNA表達(dá)量較空白對照組顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，大黃素能顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的CYP3A(除1 g/kg大黃素組外)和CYP1A表達(dá)量的上調(diào)(P<0.05)，且隨著大黃素劑量的升高，抑制作用愈加顯著。

3 討論

3.1 大黃素對建鯉生長的影響

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，綠色養(yǎng)殖、健康養(yǎng)殖在生產(chǎn)過程中越來越重要。中草藥作為天然藥物，具有資源豐富、污染少及毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，其作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于動物的養(yǎng)殖[16]。楊維維等[17]在探討大黃素對克氏螯蝦生長的影響時發(fā)現(xiàn)，飼料中添加50～75 mg/kg的大黃素，可顯著提高克氏螯蝦的成活率，降低餌料系數(shù)。明建華等[18]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加大黃素可顯著提高團(tuán)頭魴的增重率和特定生長率，降低死亡率及餌料系數(shù)。本研究中也得到了一致的結(jié)果，飼料中添加大黃素后，建鯉的終體質(zhì)量、相對增重率和特定生長率得到了顯著提高，而餌料系數(shù)顯著下降，這表明飼料中添加大黃素可幫助建鯉消化吸收、促進(jìn)其進(jìn)食，從而加速魚體的生長，提高餌料的利用效率。

3.2 大黃素對建鯉肝功能指標(biāo)的影響

作為經(jīng)典的誘導(dǎo)動物肝損傷模型的毒物CCl4，其肝損傷機(jī)制主要與自身和其自由基代謝產(chǎn)物有關(guān)。CCl4經(jīng)肝微粒體CYP450酶活化分解產(chǎn)生三氯甲烷自由基( CCl3·),引起肝細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜脂質(zhì)過氧化，從而改變了膜的流動性和通透性，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞受損，此過程目前被認(rèn)為是主要的肝損傷機(jī)制[19]。本研究中將30%的CCl4-橄欖油溶液腹腔注射建鯉72 h后，血清中GOT、GPT和LDH活性上升,證明CCl4改變了肝細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致了胞漿內(nèi)可溶性酶的溶出；同時肝細(xì)胞受損后，其合成白蛋白的能力降低，導(dǎo)致白蛋白和總蛋白含量下降。而5 g/kg的大黃素可顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的酶含量上升，表明大黃素可以抵抗磷脂氧化，穩(wěn)定細(xì)胞膜。展玉濤等[20]利用CCl4制備大鼠肝纖維化模型研究了大黃素對肝功能的影響，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，大黃素能明顯抑制CCl4誘導(dǎo)的血清GOT水平的提高，恢復(fù)白蛋白和總蛋白含量。

大量研究表明，大黃素具有理想的抗氧化作用。Yen等[21]研究蒽醌和蒽酮的抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)，大黃素和蘆薈大黃素具有較強(qiáng)的還原活性和清除羥基自由基的作用，在0.25 mg/mL濃度下的清除率分別達(dá)到26.2%和41.8%，表明其抗氧化機(jī)制可能依賴于清除羥自由基。羅霄山[22]發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞在蘆薈大黃素預(yù)培后，CCl4導(dǎo)致的肝組織中GSH損耗及MDA生成得到了明顯的抑制。楊維維等[17]的研究也表明，飼料中添加大黃素能顯著提高克氏螯蝦的肝臟抗氧化能力，肝組織中GSH、SOD含量均顯著上升。本研究中利用DPHH法測定大黃素清除自由基能力，發(fā)現(xiàn)大黃素為6 μg/mL時，清除自由基能力達(dá)到了81%；建鯉飼喂大黃素2個月后，能顯著抵抗CCl4導(dǎo)致的肝大，肝指數(shù)顯著降低，生長性能得到顯著提高，能明顯抑制CCl4導(dǎo)致的肝組織勻漿中的SOD、GSH-Px及GSH含量的損耗，且顯著抑制脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物MDA的大量生成，T-AOC水平得到顯著提高，這些結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)論一致。大黃素對CCl4誘導(dǎo)的建鯉肝損傷的保護(hù)作用應(yīng)與其抗氧化能力有關(guān)。

3.3 大黃素對建鯉肝微粒體中CYP450酶的影響

CYP450酶系作為機(jī)體的生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可以廣泛的代謝體內(nèi)外源性物質(zhì)[23]。CCl4在體內(nèi)進(jìn)行代謝活化的過程中，CYP450酶系發(fā)揮了關(guān)鍵作用，Shibata等[24]研究表明，肝組織中CYP2E1基因與CCl4誘導(dǎo)的肝損傷關(guān)系密切，Zhou等[25]研究認(rèn)為，CYP1A1、CYP1A2及CYP3A4等代謝在CCl4的生物轉(zhuǎn)化過程中同樣具有重要作用。魚類CYP1A基因在1988年被克隆后，發(fā)現(xiàn)其能被外源性化合物誘導(dǎo)且表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)[26]，苯并芘、多環(huán)芳烴、二噁英等農(nóng)藥都是CYP1A的誘導(dǎo)劑[27]，這種誘導(dǎo)作用使得CYP1A成為檢測水體污染的指標(biāo)之一。CYP3A在肝臟和小腸中含量豐富，分別約占CYP總量的30%和70%，是參與臨床常用藥物氧化代謝的主要酶系，是CYP家族中最重要的亞族成員[28]。研究CYP1A和CYP3A在CCl4代謝過程中的變化對剖析CCl4的損傷機(jī)理、防護(hù)及藥物的選擇都有指導(dǎo)意義[29]。 鄭天慧等[30]在比較3種化學(xué)品導(dǎo)致的急性肝損傷大鼠模型中CYP450酶的變化時發(fā)現(xiàn)，CCl4能抑制大鼠CYP1A2和CYP3A4活性。而劉移民等[31]研究發(fā)現(xiàn)，CCl4對人體淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞株中CYP2E1和CYP3A4基因有明顯的誘導(dǎo)作用，且表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。沈俊輝等[32]研究發(fā)現(xiàn)，CCl4對大鼠肝組織中CYP3A表達(dá)顯著上調(diào)。由此可見，目前CYP450酶各亞族在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷過程中含量變化表現(xiàn)并不統(tǒng)一，但與CCl4作用時間和劑量有關(guān)聯(lián)[33]。本研究中CCl4作用建鯉72 h后，模型組肝微粒體中CYP450酶含量顯著增加，肝組織中CYP1A、CYP3AmRNA表達(dá)量也顯著上調(diào)。這表明CCl4可以通過誘導(dǎo)CYP450酶活性及CYP1A和CYP3A的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)CCl4人代謝，使得毒性產(chǎn)物累積，導(dǎo)致建鯉肝組織的損傷。本研究中采用大黃素飼喂建鯉60 d后，大黃素能顯著降低肝組織CYP450酶含量，且表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。這表明大黃素對肝組織的保護(hù)作用與抑制CCl4對CYP450酶的誘導(dǎo)有關(guān)。

綜上所述，大黃素對CCl4誘導(dǎo)的建鯉肝損傷具有保護(hù)作用且存在劑量效應(yīng)?？赡芘c其強(qiáng)大的抗氧化能力及抑制CCl4對CYP450酶的誘導(dǎo)有關(guān)。