（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

1 引言

熊蜂（Bombus spp.）是一種重要的傳粉昆蟲(chóng)[1]，在維持植物多樣性和生態(tài)平衡方面起著極其重要的作用[2-4]。熊蜂與蜜蜂相比，個(gè)體更大，渾身帶有密密的絨毛[5]，可以進(jìn)行聲震授粉，對(duì)于一些花冠較深的植物具有更高的授粉效率，趨光性較弱，其在溫室授粉時(shí)不易發(fā)生撞棚的現(xiàn)象，信息交流系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，能夠?yàn)樘厥鈿馕兜淖魑铮ɡ绶眩┻M(jìn)行授粉，較強(qiáng)的耐寒性和溫度適應(yīng)性使其可以在低溫下正常工作，6℃就可以出巢，8～10℃就能夠正常授粉。每年人們都利用大量蜂群為農(nóng)作物、水果、藥材等農(nóng)作物進(jìn)行授粉，尤其是溫室中的番茄。對(duì)于某些設(shè)施果樹(shù)，熊蜂授粉的效果也明顯高于蜜蜂[6-8]。近年來(lái)熊蜂授粉在多種農(nóng)作物上得到廣泛應(yīng)用，如番茄、茄子、辣椒、草莓、藍(lán)莓、南瓜、中草藥等[9-11]。相對(duì)人工授粉，經(jīng)過(guò)熊蜂授粉的農(nóng)作物，不僅在產(chǎn)量方面有顯著提高，而且極大地改善了果實(shí)品質(zhì)。隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，熊蜂作為設(shè)施作物的優(yōu)良傳粉昆蟲(chóng)被廣泛應(yīng)用，歐洲熊蜂作為商品蜂在全球范圍內(nèi)使用最為廣泛。在熊蜂的人工繁育中，蜂王和雄性蜂的交配是影響熊蜂成群率的重要因素之一，而熊蜂蜂王和雄性蜂性成熟等內(nèi)在原因是影響交配行為的重要因素。研究影響熊蜂交配的因素，能夠更好地促進(jìn)熊蜂人工繁育的進(jìn)程，保障熊蜂能夠更好地為設(shè)施作物授粉。

熊蜂的人工繁育是進(jìn)行大規(guī)模溫室授粉應(yīng)用的前提，1921年出版了第一部對(duì)熊蜂人工繁育進(jìn)行系統(tǒng)研究的專著，由此展開(kāi)熊蜂人工繁育的新進(jìn)程，我國(guó)對(duì)熊蜂的研究應(yīng)用始于1996年[12]。熊蜂的種群發(fā)育不同于蜜蜂，整個(gè)蜂群由單只越冬蜂王構(gòu)建，而蜂王的成功越冬受到交配成敗、食物儲(chǔ)存及外界環(huán)境等諸多因素的影響，蜂王的交配成功與否對(duì)整個(gè)蜂群的發(fā)展有重要意義。由于大多數(shù)熊蜂的生命周期是一年一代，一般是以交配后的蜂王單獨(dú)越冬，并在第二年的春天構(gòu)建蜂群，而交配失敗的蜂王則不能越冬，即使未交配蜂王成功越冬也無(wú)法構(gòu)建蜂群[13-15]。研究表明，在一些社會(huì)性昆蟲(chóng)中，雌性會(huì)進(jìn)行多次交配，這樣可以降低昆蟲(chóng)種群內(nèi)的親緣關(guān)系，從而在種群遺傳方面展現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。在熊蜂中也發(fā)現(xiàn)有多雄交配的蜂種[16-18]，但是大多數(shù)種類的蜂王只能交配一次，如Schmid-Hempel 等研究了8種熊蜂的交配規(guī)律，發(fā)現(xiàn)只有眠熊蜂（B.hypnorum）蜂王存在多雄交配的現(xiàn)象，而其他蜂王包括歐洲地熊蜂都是單雄交配。研究表明單雄交配的熊蜂蜂王在交配成功后，雄性蜂留交配栓在蜂王體內(nèi)，阻止其他雄性蜂再次和蜂王交配[19]。Inoue等研究發(fā)現(xiàn)在日本野生歐洲地熊蜂蜂王交配頻率明顯高于人工飼養(yǎng)的蜂王[20]。歐洲熊蜂蜂王的平均交配持續(xù)時(shí)間約為30min[14]。另外Tasei等研究了歐洲地熊蜂雄性蜂的輸精管和貯精囊內(nèi)精子數(shù)量和活力在羽化后13日齡會(huì)逐漸下降，因此12日齡雄性蜂和蜂王交配成功率最高[18]。在人工控制的交配環(huán)境中，歐洲熊蜂蜂王最佳交配日齡為8～9d，雄性蜂為11～12d，蜂王和雄性蜂的數(shù)量比例為1∶1.5[1,21]，此時(shí)熊蜂交配成功率最高。熊蜂蜂王和雄性蜂交配行為是影響熊蜂繁育的重要因素之一，不同熊蜂種類具有不同的交配習(xí)性，有些蜂種交配時(shí)間較短，幾分鐘之內(nèi)完成交配，有些蜂種交配時(shí)間長(zhǎng)達(dá)四五十分鐘。研究表明，交配持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)精子轉(zhuǎn)移越多，在熊蜂交配過(guò)程中，交配前的潛伏時(shí)間（以蜂王進(jìn)入交配籠到開(kāi)始與雄性蜂交配為潛伏時(shí)間，所處階段為潛伏期）越短，交配成功率越高。影響熊蜂交配有多種因素，外界因素包括溫濕度、光照、雌雄比等，內(nèi)部因素包括性成熟程度、個(gè)體發(fā)育狀態(tài)、腸道菌群調(diào)節(jié)以及個(gè)體大小等。

熊蜂每年為農(nóng)作物授粉帶來(lái)巨大的價(jià)值，近年來(lái)熊蜂在設(shè)施農(nóng)作物中授粉應(yīng)用逐漸擴(kuò)大，人們對(duì)熊蜂質(zhì)量和數(shù)量的要求也與日俱增，此時(shí)熊蜂的人工繁育技術(shù)受到重視。目前研究顯示雌雄比、密度、光照、溫濕度等綜合因素影響熊蜂蜂王和雄性蜂的交配。但是熊蜂日齡及體重對(duì)交配的影響研究很少，因此，本研究從蜂王日齡及體重與交配前的潛伏時(shí)間、交配持續(xù)時(shí)間和交配成功率三個(gè)方面的相關(guān)性來(lái)研究對(duì)蜂王交配造成的影響。目前研究報(bào)道關(guān)注外部因素，從熊蜂內(nèi)部因素研究報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)中，基于熊蜂個(gè)體發(fā)育情況，從熊蜂內(nèi)部尋找影響交配行為的因素，研究熊蜂不同日齡的交配時(shí)間、潛伏時(shí)間及其交配率之間的關(guān)系，探討影響熊蜂交配的因素，為熊蜂人工繁育過(guò)程中蜂王的篩選及商品化繁育提供一定的依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 熊蜂樣本采集

歐洲地熊蜂蜂王和雄性蜂均來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所授粉飼養(yǎng)室，樣本取自蜂群后期。在蜂群中挑選初羽化蜂王于飼養(yǎng)箱中進(jìn)行單獨(dú)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度26±1℃，相對(duì)濕度50%±5%，在黑暗環(huán)境下飼喂50%的糖水和花粉，按照出房日齡進(jìn)行取樣。所取樣本分別為羽化后3d、4d、5d、6d和7d，每天取15只，3個(gè)重復(fù)，共計(jì)225只，雄性蜂為性成熟蜂，性成熟蜂王稱量體重后進(jìn)行交配試驗(yàn)。

2.2 交配環(huán)境的設(shè)置

設(shè)置熊蜂交配環(huán)境，控制實(shí)驗(yàn)溫度為26±1℃，人工控制光源，交配時(shí)間控制在上午8∶00～12∶00[22]，準(zhǔn)備規(guī)格為100cm×100cm×100cm的交配籠，材質(zhì)為棉質(zhì)網(wǎng)的面罩，骨架為不銹鋼。從飼養(yǎng)室中取出不同熊蜂蜂群的蜂王和雄性蜂，稱量蜂王體重并編號(hào)記錄，交配雌雄比為1∶2[1,21]，即每次交配包括15只蜂王和30只性成熟雄性蜂。

2.3 蜂王不同交配狀態(tài)下體重的稱量

不同交配狀態(tài)蜂王體重的測(cè)量：隨機(jī)選擇50只性成熟蜂王稱量體重并標(biāo)號(hào)，按照雌雄比1∶2和性成熟雄性蜂投于交配籠中，待交配結(jié)束后，收集成功交配和未成功交配的蜂王重新稱量體重并記錄，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 蜂王不同體重對(duì)交配行為的影響

不同體重蜂王對(duì)交配率的影響：隨機(jī)選取性成熟蜂王50只進(jìn)行體重稱量并編號(hào)，按照蜂王體重分為Big和Small兩組，將不同組別蜂王按照雌雄比1∶2與性成熟雄性蜂置于上述交配籠中觀察交配情況。蜂王體重對(duì)其潛伏時(shí)間的影響：選擇性成熟蜂王稱量體重并編號(hào)記錄，按照體重由小至大分為A、B、C、D四組，與性成熟雄性蜂按照雌雄比1∶2投入交配籠中后觀察其潛伏時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，于2019年6月～2020年1月進(jìn)行。

2.5 數(shù)據(jù)分析

首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出不同出房日齡熊蜂蜂王在交配籠中的潛伏時(shí)間、交配時(shí)間和交配率，利用狄克遜法則刪除異常值，采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)整理數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，選擇多項(xiàng)式，LSD（L）、Duncan（D）。比較體重對(duì)熊蜂交配的影響程度，通過(guò)潛伏時(shí)間和交配率整理信息，最后利用GraphPad 6繪制柱形圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 蜂王日齡對(duì)交配的影響

圖1 熊蜂不同出房時(shí)間交配指標(biāo)

在不同出房日齡的處女王與性成熟雄性蜂交配實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果表明蜂王交配率隨其日齡的增長(zhǎng)而升高，出房日齡3d交配率為24.44%，4d為28.89%，5d為40%，6d為57.78%，7d為71.11%，蜂王出房3d與4d無(wú)明顯差異，4d、5d、6d、7d的交配率差異均顯著（P＜0.05）。如圖1所示，潛伏時(shí)間與交配率呈負(fù)相關(guān)，隨交配率的逐漸升高，蜂王在交配籠中的潛伏時(shí)間逐漸縮短，從蜂王出房3d時(shí)的31.25min縮短到7d時(shí)的10.55min，差異顯著（P＜0.05）。不同日齡的蜂王交配持續(xù)時(shí)間無(wú)明顯差異（P＞0.05），且在30min上下波動(dòng)。

3.2 蜂王體重對(duì)交配的影響

表1 不同日齡蜂王的交配特征分析

我們測(cè)量了交配成功的蜂王和交配失敗蜂王的體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明交配成功的蜂王平均體重為0.837g，顯著大于交配失敗的蜂王0.702g（圖2b）。同時(shí)我們對(duì)交配前后蜂王體重進(jìn)行稱量，發(fā)現(xiàn)交配失敗的蜂王交配前體重比交配后減輕29.8mg，而交配成功的蜂王在交配后蜂王體重減輕26.367mg，但是差異不顯著（P＞0.05），如圖2a所示，此外，交配成功和交配失敗的蜂王在交配后體重都有減少，但是差異不顯著（P＞0.05）。

3.3 蜂王體重對(duì)潛伏時(shí)間的影響

我們發(fā)現(xiàn)熊蜂蜂王交配率與潛伏時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，不同交配狀態(tài)蜂王的體重具有明顯差異，根據(jù)體重對(duì)蜂王分組，A組體重0.4～0.6g，B組0.6～0.8g，C組0.8～1.0g，D組1.0～1.2g，結(jié)果表明蜂王體重影響蜂王的交配率和潛伏時(shí)間。A組蜂王交配率為32.52%，和B組無(wú)顯著差異，但顯著低于C組（70.02%）和D組（70.09%）。同時(shí)蜂王不同體重對(duì)潛伏時(shí)間有明顯影響，體重越大，潛伏時(shí)間越短，A組潛伏時(shí)間為25min，B組為14.57min，C組為11.5min，D組為7.83min，D組潛伏時(shí)間顯著低于A組。

4 討論

熊蜂的交配主要受到自身性成熟和外界環(huán)境的影響[21]，本實(shí)驗(yàn)中我們模擬自然界環(huán)境條件，選擇不同日齡的熊蜂蜂王與性成熟雄性蜂于交配籠中進(jìn)行交配。結(jié)果表明隨蜂王出房日齡增加，熊蜂交配率逐漸升高。熊蜂蜂王羽化出房后，在發(fā)育過(guò)程中機(jī)體各機(jī)能趨于完善，逐漸達(dá)到性成熟，交配率隨日齡增大逐漸增高，7日齡交配成功率達(dá)到最高，說(shuō)明7日齡蜂王達(dá)到性成熟。

表2 蜂王交配前后體重變化

圖2 交配行為和體重之間的關(guān)系

圖3 不同體重熊蜂的交配率及潛伏時(shí)間

人工控制交配時(shí)間為60min，在交配籠中進(jìn)行熊蜂蜂王和雄性蜂的交配。蜂王投入交配籠至開(kāi)始與雄性蜂交配為蜂王的潛伏時(shí)間，蜂王進(jìn)入交配籠后需要適應(yīng)籠內(nèi)環(huán)境并對(duì)雄性蜂釋放性信息素吸引雄蜂來(lái)交配，完成其歷史使命[23]。隨日齡增長(zhǎng)，蜂王潛伏時(shí)間逐漸縮短，能夠盡快完成交配，熊蜂日齡越大，性激素和生殖功能趨于完善，能夠在短時(shí)間內(nèi)吸引雄性蜂來(lái)交配。熊蜂蜂王潛伏時(shí)間跟多種因素有關(guān)，已有研究證明雄性蜂體重越大，交配潛伏期越短[24]，自然環(huán)境下，潛伏時(shí)間越短，能夠盡快完成交配。所受到的外界威脅越小，種群繁衍成功率達(dá)到最高水平，這是自然界適應(yīng)環(huán)境的選擇結(jié)果。

熊蜂交配持續(xù)時(shí)間在不同日齡下相對(duì)穩(wěn)定，維持在30min上下，無(wú)明顯差異，前人研究表明蜂王交配平均時(shí)間為30min，交配時(shí)間和雄性蜂有關(guān)，和蜂王無(wú)關(guān)[25,26]。熊蜂交配時(shí)間與雄性蜂精子的轉(zhuǎn)移數(shù)量有關(guān)，交配時(shí)間的穩(wěn)定能夠確保精子轉(zhuǎn)移量一致，保證了后代的種群數(shù)量。出房3d蜂王交配時(shí)間為28.58min，7d為29.33min，性成熟度不同的蜂王交配時(shí)間無(wú)明顯差異，但交配率差異顯著（P＜0.05）。同一出房時(shí)間的蜂王在個(gè)體上也存在區(qū)別，在交配中，日齡小的蜂王交配率較低，這和蜂王和雄性蜂之間的雙向選擇有關(guān)，雄性蜂選擇發(fā)育程度高、性狀優(yōu)良的蜂王完成交配[23]，避免選擇發(fā)育程度低的蜂王，進(jìn)而保證交配時(shí)間的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)蜂王單次交配，和Mikheyev A.S研究一致，已有研究表明，果蠅的多次交配會(huì)縮短雌性的壽命，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在蜂王和雄性蜂交配停止后，繼續(xù)往交配籠中補(bǔ)充雄性蜂會(huì)提高交配率，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是什么目前還不清楚，需要進(jìn)一步的研究[27-29]。

在熊蜂交配過(guò)程中，雄性蜂會(huì)將大量精子轉(zhuǎn)移至蜂王受精囊中[30]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明交配成功的蜂王體重明顯比交配失敗的蜂王要重，差異顯著（P＜0.05），這可能與交配成功蜂王受精囊中的精子有關(guān)。在交配實(shí)驗(yàn)中，我們可以看到蜂王和雄性蜂會(huì)進(jìn)行飛翔來(lái)尋找伴侶[22]，這一過(guò)程中消耗大量體能，從而體重下降，但交配前后的體重變化無(wú)明顯差異（P＞0.05），在此過(guò)程中未交配蜂王比交配蜂王選擇伴侶時(shí)間更長(zhǎng)，因此體重下降更多，但交配前后體重變化仍無(wú)明顯差異。

熊蜂的體重作為熊蜂發(fā)育程度的一項(xiàng)指標(biāo)在熊蜂飼養(yǎng)中經(jīng)常應(yīng)用[31]，熊蜂的體重越大，說(shuō)明熊蜂發(fā)育程度越好。蜂王體重對(duì)熊蜂繁育過(guò)程有著重要影響，越冬前蜂王體重最小為0.6g，平均0.8g，桉樹(shù)長(zhǎng)角螟體重越大，交配成功率越高[32,33]。本實(shí)驗(yàn)中體重大的熊蜂交配率明顯高于體重小的蜂王，證明熊蜂蜂王體重是影響熊蜂交配成功率的重要因素之一。研究表明昆蟲(chóng)個(gè)體大小直接決定配偶的選擇性，進(jìn)而影響交配成功率[34]。由于在熊蜂幼蟲(chóng)期吸收的營(yíng)養(yǎng)水平不同，所以成蟲(chóng)在個(gè)體大小上具有一定差異，即使同一群中的熊蜂個(gè)體間也存在著差異。熊蜂通過(guò)吸收營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)體重，促進(jìn)機(jī)體發(fā)育。實(shí)施農(nóng)業(yè)授粉中，熊蜂個(gè)體大小與授粉效果有關(guān)，熊蜂依靠聲震授粉，個(gè)體大的熊蜂能夠更好地進(jìn)行田間授粉。選擇個(gè)體大的蜂王進(jìn)行種群繁育，能夠確保熊蜂人工繁育的優(yōu)良，節(jié)約人工成本，實(shí)現(xiàn)資源最大化。

5 結(jié)論

在人工控制交配條件下，歐洲熊蜂蜂王的交配率隨其日齡的增加而不斷升高，潛伏時(shí)間不斷縮短，但交配時(shí)間保持平穩(wěn)，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。體重對(duì)蜂王的交配有著直接的影響，蜂王體重較大會(huì)縮短其潛伏時(shí)間并提高交配率，但我們對(duì)不同交配狀態(tài)蜂王（交配成功、交配失?。┙慌淝昂篌w重變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明兩者無(wú)明顯差異，在熊蜂的人工繁育中選擇性成熟且體重較大的蜂王有利于熊蜂的交配。