磷酸甘油酸變位酶1及其抑制劑的研究進展

梁倩，陳紅專，沈瑛*

（1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與化學(xué)生物學(xué)系，上海 200025； 2. 上海市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200025；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

腫瘤細胞在有氧環(huán)境下提高糖酵解率和乳酸產(chǎn)量以滿足快速增殖的能量需求方式被稱為Warburg效應(yīng)[1]。磷酸甘油酸變位酶1（phosphoglycerate mutase 1，PGAM1）是糖酵解通路中的代謝酶之一，其可催化3-磷酸甘油酸（3-phosphoglycerate，3-PG）轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酸（2-phosphoglycerate，2-PG），調(diào)控底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化平衡，進而影響糖酵解通路速率及其他代謝通路，促進腫瘤生長[2]。研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1不僅通過其代謝酶活性參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還可以通過非代謝酶功能介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移[3]。PGAM1有望作為抗腫瘤治療的新靶點，其抑制劑也成為研究熱點[4]。

1 磷酸甘油酸變位酶1的結(jié)構(gòu)和催化機制

編碼PGAM1基因位于染色體10 q25.3，其cDNA長度為 1 709 bp，編碼254個氨基酸長度的蛋白，相對分子質(zhì)量為28 784[5]。研究發(fā)現(xiàn)，His11、Arg62和 His186均位于PGAM1活性位點[6]。PGAM2與PGAM1約有80%的同源性，在人類基因組中PGAM2僅有一個基因拷貝，PGAM1則是多拷貝基因，因此認為PGAM2基因可能來源于PGAM1[7]。PGAM3和PGAM4最初被認為是假基因[8-9]，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，PGAM3活動中心的必需氨基酸序列與PGAM1相同，表明PGAM3可能與PGAM1有相似的酶活性[10]，PGAM4則主要在睪丸中表達，與男性不育有關(guān)[11]。PGAM5定位在線粒體外膜，雖然在結(jié)構(gòu)上屬于磷酸甘油酸變位酶家族，卻缺乏酶活性，可作為一種特殊的絲/蘇氨酸磷酸酶參與細胞凋亡[12-13]。

PGAM1通過“乒乓機制”來催化3-PG到2-PG之間的可逆轉(zhuǎn)化[14]（見圖1）。在反應(yīng)開始階段，PGAM1的His11氨基酸殘基被磷酸化，PGAM1處于激活狀態(tài)。當3-PG進入反應(yīng)口袋，PGAM1的His11殘基上的磷酸根轉(zhuǎn)移到3-PG上形成2，3-二磷酸甘油酸（2，3-diphosphoglycerate，2，3-BPG）；而去磷酸化后的PGAM1發(fā)生構(gòu)象改變，促進2，3-BPG上3位的磷酸根轉(zhuǎn)移到PGAM1的His11殘基上，PGAM1恢復(fù)其開始的激活狀態(tài)并生成2-PG。

圖 1 PGAM1催化反應(yīng)的“乒乓機制” [14]Figure 1 The "ping-pong mechanism" of PGAM1 catalytic reaction [14]

Hitosugi等[15]解析了更高分辨率的人源PGAM1的晶體結(jié)構(gòu)（PDB: 4GPI，2.02 ?；4GPZ，1.65 ?），這2個PGAM1結(jié)構(gòu)分別是His11未磷酸化的原始狀態(tài)和His11被磷酸化的激活狀態(tài)（見圖2）。 對比2個結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在His11磷酸化的PGAM1中，靠近His11的loop（12-23）有較大的構(gòu)象改變，控制著活性口袋的開關(guān)（見圖2a）。在His11未被磷酸化的原始狀態(tài)中，Tyr26與Trp16相互堆疊，帶負電的Glu19占據(jù)著帶正電的底物結(jié)合口袋，阻止了2，3-BPG和3-PG進入活性口袋，且Glu19與Ser14和Ser23形成氫鍵，進一步穩(wěn)定了該原始狀態(tài)PGAM1的構(gòu)象（見圖2b）。而在His11磷酸化的PGAM1中，Glu19不再占據(jù)底物結(jié)合口袋，磷酸化的His11的帶負電的磷酸根進入活性反應(yīng)區(qū)，并且，磷酸化的His11通過磷酸根與周圍的Arg10、Arg62和Glu89形成很強的氫鍵，這些氫鍵相互作用也穩(wěn)定了His11磷酸化的激活狀態(tài)PGAM1的結(jié)構(gòu)（見圖2c）。

圖 2 His11磷酸化和His11非磷酸化PGAM1的結(jié)構(gòu)對比[15]Figure 2 Structural comparison of PGAM1 with His11 phosphorylation and His11 non-phosphorylation [15]

2 磷酸甘油酸變位酶1與腫瘤的關(guān)系

PGAM1在多種腫瘤中普遍高表達，如乳腺癌[16]、膽管癌[17]、腎透明細胞癌[18]、前列腺癌[19]和膠質(zhì)瘤[20]等。臨床數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，PGAM1表達水平與腫瘤患者預(yù)后呈負相關(guān)，與腫瘤組織分級和嚴重程度呈正相關(guān)，如肺癌[21]、口鱗狀細胞癌[22]、泌尿道上皮膀胱癌[23]、結(jié)直腸癌[24]、肝癌[25]、胰腺癌[26]等，在腫瘤的發(fā)展進程中扮演重要角色。

Cortesi等[16]通過雙向凝膠電泳和質(zhì)譜法檢測了乳腺癌患者的組織液，發(fā)現(xiàn)PGAM1在腫瘤間質(zhì)液中顯著高表達。另有研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體陰性/黃體酮受體陰性乳腺癌患者中，PGAM1表達明顯高于類固醇受體陽性乳腺癌患者[27]。Ishikawa等[28]發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的乳腺癌細胞中不僅PGAM1增加，而且表現(xiàn)出與癌癥相關(guān)的成纖維細胞樣特性。Shen等[17]通過western blot證實PGAM1在膽管癌患者的膽汁樣本中顯著上調(diào)。研究表明，PGAM1可能是膽管癌的一種潛在的生物標志物。免疫組化結(jié)果表明，腎透明細胞癌中PGAM1表達高于正常腎組織，并且與患者年齡、腫瘤大小和T分期有顯著的相關(guān)性[18]。Wen等[19]檢測發(fā)現(xiàn)PGAM1在前列腺癌組織和細胞系中表達上調(diào)，PGAM1表達與Gleason評分和T分期相關(guān)；下調(diào)PGAM1能夠抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生凋亡，提示PGAM1在前列腺癌的進展和侵襲過程中發(fā)揮重要作用，可能是預(yù)后不良的有價值的標志物和潛在的治療靶點。Gao等[20]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤病人樣本中PGAM1的表達量顯著高于正常腦組織，并且PGAM1的表達量與膠質(zhì)瘤患者的分級及生存相關(guān)。當siRNA敲除PGAM1后，顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，誘導(dǎo)S期細胞周期阻滯，抑制細胞遷移和侵襲[29]。Sanzey等[30]通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下膠質(zhì)瘤中PGAM1水平明顯升高。

Huang等[31]通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌病人腫瘤組織中PGAM1明顯高于癌旁組織， PGAM1的異常高表達與肺癌病人的不良預(yù)后密切相關(guān)[21]。Zhang等[22]通過對口腔鱗狀細胞癌患者組織標本進行分析，發(fā)現(xiàn)PGAM1的表達與病人年齡、淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，并且高表達PGAM1的病人總生存期和無病生存期較短。Turhani等[32]發(fā)現(xiàn)PGAM1可作為口腔鱗癌中潛在的診斷標志物，具有臨床意義。Usuba等[24]研究發(fā)現(xiàn)PGAM1在結(jié)腸直腸癌患者中顯著高表達，Liu 等[33]發(fā)現(xiàn)PGAM1 能夠與T細胞淋巴瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)蛋白1相互作用，激活Rac介導(dǎo)的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。分子機制探究和病理分析表明PGAM1與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)[34]。臨床病理分析表明，肝癌中PGAM1蛋白過表達，且與低分化、低生存率密切相關(guān)。敲低PGAM1導(dǎo)致肝癌細胞的生長受到明顯抑制。研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1在肝癌發(fā)生過程中起著重要的作用，是一種潛在的診斷性生物標志物[25]。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1的過表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的轉(zhuǎn)移、臨床晚期、生存率低呈正相關(guān)，敲低PGAM1抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細胞增殖，表明PGAM1與胰腺癌的臨床轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。

3 磷酸甘油酸變位酶1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

PGAM1在糖酵解通路中催化3-PG轉(zhuǎn)化為2-PG，不僅能調(diào)控糖酵解速率，而且還通過調(diào)控底物和產(chǎn)物的濃度來影響其他代謝酶活性，進而影響整個代謝網(wǎng)絡(luò)，在腫瘤生長中發(fā)揮著重要作用。Hitosugi等[2]研究發(fā)現(xiàn)，3-PG在細胞內(nèi)的積累會競爭性抑制6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性，影響磷酸戊糖途徑，降低核苷酸等物質(zhì)的生成；2-PG的積累則增強糖酵解通路向絲氨酸合成通路轉(zhuǎn)變的起始關(guān)鍵酶磷酸甘油酸脫氫酶的活性，促進絲氨酸的生成，因此，PGAM1能同時調(diào)控有氧糖酵解、磷酸戊糖途徑和絲氨酸合成通路，實現(xiàn)對能量代謝和氨基酸、核苷等生物大分子合成的諸多調(diào)控（見圖3）。其中，Tyr26殘基對于PGAM1至關(guān)重要，PGAM1 Tyr26磷酸化促使Glu19從活性中心釋放，His11進而與2，3-BPG結(jié)合穩(wěn)定PGAM1結(jié)構(gòu)，增強酶活性[15]。

Ren等[25]對PGAM1調(diào)控腫瘤細胞增殖的機制提出一種新的可能性：PGAM1活性的改變影響了ATP的合成，AMP依賴的蛋白激酶 [adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]在感受到AMP/ATP的變化后信號通路隨之激活，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）下游的信號分子主要調(diào)控細胞的增殖、凋亡和自噬，進而影響肝癌生長。并且，AMPK還會影響乙酰輔酶A羧化酶，進一步調(diào)控細胞內(nèi)脂肪酸的合成（見圖3）。Qu等[35]報道了PGAM1對腫瘤細胞DNA損傷應(yīng)答的調(diào)控機制。研究揭示，PGAM1通過酶活功能調(diào)控磷酸戊糖旁路，維持細胞內(nèi)DNA合成元件——脫氧核糖核苷三磷酸池（deoxyribonucleoside triphosphates pool，dNTP pool）的水平。細胞內(nèi)dNTP失衡，能激活p53/p73依賴的APC/C-Cdh1 E3泛素連接酶活性，下調(diào)DNA同源重組修復(fù)（homologous recombination，HR）核心蛋白羧基末端結(jié)合蛋白反應(yīng)蛋白（C-terminal binding protein interacting protein，CtIP）的穩(wěn)定性，進而影響HR修復(fù)通路功能（見圖3）。

圖 3 腫瘤細胞中PGAM1的代謝功能調(diào)控示意圖 [2,25,35]Figure 3 Schematic diagram of the metabolic regulation mechanism of PGAM1 in cancer cells [2,25,35]

Liu等[26]發(fā)現(xiàn)敲低胰腺癌細胞中PGAM1后β-catenin磷酸化水平增加，表明PGAM1可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路進而促進細胞發(fā)生上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，使用磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）或mTOR抑制劑后，PGAM1總蛋白水平降低，表明PGAM1可能處于mTOR下游并且受到PI3K/Akt信號通路調(diào)控。Shen等[36]研究發(fā)現(xiàn)，S1P/S1PR3信號通路通過調(diào)控Yes相關(guān)蛋白1-骨髓細胞瘤病毒癌基因（Yesassociated protein 1-cellular-myelocytomatosis viral oncogene，YAP-c-MYC）復(fù)合物進而促進PGAM1轉(zhuǎn)錄，增強有氧糖酵解，有利于腫瘤增殖。

PGAM1不僅通過其代謝酶功能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還存在非酶活功能介導(dǎo)腫瘤運動。已有文獻報道通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）敲低胰腺癌細胞中的PGAM1，缺氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）蛋白總量明顯下調(diào)，反向敲低HIF-1α后PGAM1蛋白水平也隨之降低，表明兩者之間可能存在直接的相互作用[26]。Zhang等[3]發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞中PGAM1通過其201-210位氨基酸，直接與α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，ACTA2）相互作用，進而調(diào)控肌動蛋白絲組裝和腫瘤細胞運動。Huang等[37]報道了一種新型的PGAM1變構(gòu)抑制劑，當其結(jié)合在變構(gòu)位點后能夠拉近氨基酸殘基Arg191與Leu208之間的距離，使201-210段氨基酸的構(gòu)象發(fā)生改變，從而減弱PGAM1與ACTA2之間相互作用，抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。抑制PGAM1能夠顯著提高細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK/c-Jun）信號通路，并抑制Akt和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）活性，表明PGAM1能通過代謝酶活性和非代謝酶依賴的蛋白-蛋白相互作用，調(diào)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。

4 現(xiàn)已報道的磷酸甘油酸變位酶1抑制劑

PGAM1是一個前景良好的抗腫瘤新靶標，研究與開發(fā)新的 PGAM1抑制劑已引起越來越多研究者的關(guān)注。2005年，Evans等[38-39]報道了PGAM1抑制劑MJE3（1），課題組首先構(gòu)建了包含能與PGAM1反應(yīng)的活性基團的天然產(chǎn)物化合物庫，通過細胞增殖實驗篩選發(fā)現(xiàn)化合物MJE3可以抑制乳腺癌細胞生長，原位蛋白反應(yīng)譜顯示MJE3共價連接到PGAM1上，并降低PGAM1的活性。進一步通過質(zhì)譜、構(gòu)建突變蛋白和進行蛋白-小分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)模擬等方法確定MJE3上的環(huán)氧基團共價連接到PGAM1的Lys100位點。Li等[40]報道了天然產(chǎn)物來源的PGAM1抑制劑EGCG[(－)-epigallocatechin-3-gallate，2]。EGCG是綠茶提取物中兒茶酚的主要成分，在分子水平表現(xiàn)出對PGAM1較強的抑制活性，IC50約為 0.49 μmol · L-1。但 EGCG 為多酚結(jié)構(gòu)，其通過細胞膜效率較低，對腫瘤細胞的抑制活性較弱，并且呈現(xiàn)多靶標作用，選擇性有待進一步提高[41-43]。

2012年，Hitosugi等[2]報道了蒽醌類PGAM1抑制劑，通過高通量的酶聯(lián)測活方法，對一個包含2 000個美國FDA批準的小分子化合物庫進行篩選，鑒定出茜素紅（Red S，3）。但茜素紅結(jié)構(gòu)含有磺酸基團，導(dǎo)致該化合物很難通過細胞膜，將其磺酸基團替換成磺酰胺并進行一系列化學(xué)修飾，最終發(fā)現(xiàn)化合物PGMI-004A（4），細胞水平檢測的IC50為 25.6 μmol · L-1，具有抗腫瘤效果，但是 PGMI-004A如何與PGAM1結(jié)合以及PGMI-004A的靶向性的驗證等問題仍有待進一步探究。

同樣以PGMI-004A為先導(dǎo)化合物，Wang等[44]通過骨架躍遷發(fā)現(xiàn)了呫噸酮類PGAM1抑制劑，其中活性最好的化合物12r （5）對PGAM1和腫瘤細胞 H1299 的 IC50分別為 2.7 μmol · L-1和 5 μmol · L-1左右。但其溶解性較差并且藥物代謝性質(zhì)不理想，應(yīng)用受到限制。

Huang等[37]通過解析PGMI-004A與PGAM1的共晶復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)PGMI-004A位于鄰近底物結(jié)合口袋的變構(gòu)位點，通過疊合該共晶復(fù)合物結(jié)構(gòu)與底物3-PG發(fā)現(xiàn)，PGMI-004A與3-PG有部分碰撞?；诮Y(jié)構(gòu)進一步優(yōu)化，將PGMI-004A中的磺酰胺反轉(zhuǎn)、引入含氮飽和脂肪環(huán)，發(fā)現(xiàn)了新型PGAM1變構(gòu)抑制劑HKB99（6）。對接研究發(fā)現(xiàn)，新化合物HKB99與先導(dǎo)化合物PGMI-004A位于同一變構(gòu)位點，但磺酰胺翻轉(zhuǎn)后，HKB99巧妙地避開了與底物3-PG的碰撞，成為非底物競爭型的變構(gòu)抑制劑，大大提高了抗腫瘤活性。藥理學(xué)研究表明，HKB99通過變構(gòu)結(jié)合PGAM1后，降低了PGAM1的酶活，抑制3-PG向2-PG的轉(zhuǎn)化，進而抑制細胞增殖。同時，HKB99結(jié)合在PGAM1變構(gòu)位點后，拉近了PGAM1的Arg191與Leu208之間的距離，穩(wěn)定了201-210位氨基酸的構(gòu)象，進而阻斷PGAM1與ACTA2的結(jié)合，抑制細胞的運動和腫瘤轉(zhuǎn)移。進一步分子機制表明，HKB99可以提高細胞內(nèi)ROS水平、激活JNK/c-Jun通路誘導(dǎo)細胞凋亡并降低磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）和磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinase，p-ERK） 的 水平，從而抑制細胞增殖。簡言之，通過變構(gòu)調(diào)節(jié)PGAM1，HKB99突破了其先導(dǎo)化合物PGMI-004A的局限，實現(xiàn)了對PGAM1的代謝酶功能和基于蛋白-蛋白相互作用的非代謝酶功能的雙重抑制作用，從而全方位阻斷PGAM1促進腫瘤生長和腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，并能克服靶向藥物耐藥。

與此同時，Wen等[45]報道了PGMI-004A的另一個衍生物KH3（7），通過晶體學(xué)、體外酶學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，KH3也是PGAM1變構(gòu)抑制劑。他們分析了50例臨床胰腺癌患者的病理標本，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中PGAM1的活性明顯高于癌旁組織，并且PGAM1的表達量與患者的預(yù)后相關(guān)，提示PGAM1可以作為胰腺癌治療的潛在靶標。KH3在多種胰腺癌模型中，例如臨床病人原代腫瘤細胞、原代植入模型以及病人腫瘤異種移植瘤中均表現(xiàn)出較好的抑制腫瘤生長的效果。進一步的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，KH3還可以抑制脂質(zhì)代謝通路和Hedgehog等重要通路，并且其抑制程度與藥效相關(guān)。該研究說明了胰腺癌中代謝重編程的重要性，并提供了以調(diào)控代謝為策略的治療胰腺癌的新思路。

5 結(jié)語

PGAM1作為經(jīng)典的糖酵解通路代謝酶，在催化3-PG生成2-PG的同時也發(fā)揮著非代謝酶功能，它可以與ACTA2蛋白相互作用，調(diào)控肌動蛋白的組裝從而影響腫瘤運動。并且，臨床公共數(shù)據(jù)庫顯示PGAM1在多種腫瘤中普遍高表達，與病人的不良預(yù)后相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。因此PGAM1是抗腫瘤治療中極具潛力的靶標，其抑制劑的研發(fā)也成為熱點。

目前，針對PGAM1抑制劑的研發(fā)已經(jīng)做了大量的工作，但是仍然有一些問題未被解決。例如，天然化合物EGCG在細胞水平具有良好的抗腫瘤活性，但因其具有多靶點性質(zhì)，需要進一步提高其特異性和選擇性；新型的變構(gòu)抑制劑HKB99，具有高活性和低毒性等優(yōu)點，在抑制非小細胞肺癌增殖和轉(zhuǎn)移的同時能否作用于更多類型的腫瘤；KH3和HKB99能否進一步優(yōu)化，制備成合適的劑型并應(yīng)用于臨床等?？傊琍GAM1作為抗腫瘤治療的新靶標，其抑制劑的研發(fā)值得進一步探究。