基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀基因組在肺癌中的聯(lián)合分析

楊惠敏，何斐，胡志堅(jiān)

0 引言

近年來，以二代測序技術(shù)為代表的高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳組組學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)運(yùn)而生。在肺癌研究中，高通量測序技術(shù)應(yīng)用于各個方面，特別是治療藥物和靶點(diǎn)及預(yù)后判斷等，并且出現(xiàn)了新的研究熱點(diǎn)。

疾病的產(chǎn)生是一個持續(xù)的多步驟連鎖事件，單組學(xué)數(shù)據(jù)難以全面解釋疾病的發(fā)生過程。當(dāng)前全基因組檢測技術(shù)已可以檢測到基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組等多個層面的數(shù)據(jù)。雖然每一種組學(xué)技術(shù)都能夠準(zhǔn)確、全面地揭示一個單向水平上的大量信息，但這種簡化方法無法評估多個分子層之間的交叉，缺乏解決分子標(biāo)記和癌癥特征表型之間的偶然關(guān)系的能力，并且單一組學(xué)并不能解釋一生中疾病風(fēng)險的變化。生命過程中基因組層間的互補(bǔ)效應(yīng)和協(xié)同作用只有通過對多個分子層的綜合研究才能得到。通過它們之間線性或非線性關(guān)系等可以將三者聯(lián)系到一起，進(jìn)而使多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析成為可能[1]。關(guān)聯(lián)三個層面組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析可以有效去除單個層面的隨機(jī)事件，并觀察到真正的候選疾病候選因子在各個層面的不同變化，從而探究這些候選疾病因子的作用機(jī)制，找到最有效的治療措施[2]。多組學(xué)聯(lián)合分析已廣泛應(yīng)用于各疾病鄰域，在肺癌中也有研究，以DNA或基因分子水平作為基礎(chǔ)的多組學(xué)研究尤為重要，因此本文就肺癌的基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀基因組等基于基因水平組學(xué)的聯(lián)合研究進(jìn)展作簡要綜述，其主要的生物標(biāo)志物見表1。

1 表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合

基因表達(dá)是一個復(fù)雜的多因素調(diào)控過程。順式作用元件本身不能編碼蛋白質(zhì)，對基因表達(dá)調(diào)控起作用的是外部的轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾等反式調(diào)控元件[25]。因此，基因表達(dá)數(shù)據(jù)和表觀基因組數(shù)據(jù)的整合有助于了解信號通路活性、轉(zhuǎn)錄因子和基因組靶標(biāo)之間的作用關(guān)系，對探索疾病發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

1.1 DNA甲基化和mRNA

DNA甲基化在基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、微小RNA（microRNA,miRNA）基因表達(dá)調(diào)控和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DNA異常甲基化是一種表觀遺傳改變，基因啟動子區(qū)的異常甲基化是抑癌基因及其他基因失活的最常見機(jī)制之一[26]。盡管分析單個基因的DNA甲基化可能是選擇性治療的關(guān)鍵，但是不覆蓋整個基因組的分析具有局限性。Kwon等[3]首次結(jié)合全基因組甲基化譜和基因表達(dá)譜來識別肺鱗癌中受DNA甲基化調(diào)控的基因。Selamat等[4]整合DNA甲基化和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，分析結(jié)果表明吸煙者與從不吸煙者肺腺癌DNA甲基化譜的比較顯示差異不大，僅發(fā)現(xiàn)LGALS4在吸煙者中顯著高甲基化而表達(dá)下調(diào)。Yin等[27]側(cè)重了肺鱗癌和肺腺癌的差異甲基化位點(diǎn)和差異甲基化基因，結(jié)果顯示不同的肺癌病理類型具有不同的甲基化狀態(tài)，特異性差異甲基化發(fā)生的表達(dá)水平也存在顯著性差異。

1.2 MicroRNA和mRNA

某些條件下，miRNA可以正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)，但其內(nèi)在機(jī)制尚未闡明。Ma等[5]基于非小細(xì)胞肺癌的癌-癌旁成對樣本的miRNA-mRNA表達(dá)譜，構(gòu)建了miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，249個mRNA中有105個被miR-1207-5p、miR-1228和miR-939下調(diào)。HDAC4、MED1、SPN和ST8SIA2在肺癌中受多個miRNA的調(diào)控，說明多個miRNA的聯(lián)合作用可能在肺癌中發(fā)揮重要作用。Yang等[6]研究表明，基于mRNA和miRNA的整合分析可為非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展提供更多潛在的分子標(biāo)志物。Zhang等[7]則利用差異表達(dá)的mRNA和靶向miRNA分別構(gòu)建小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，miR-16和miR-124可能分別是小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。

表1 基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀基因組聯(lián)合分析的主要生物標(biāo)志物Table 1 Major biomarkers of integrative analysis of genome,transcriptome and epigenome

1.3 LncRNA和mRNA

LncRNA是非編碼RNA的一種類型，在表觀遺傳學(xué)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等生命活動中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在多種腫瘤中異常表達(dá)，且表達(dá)失調(diào)的lncRNA可作為腫瘤促進(jìn)或抑制因子[28]。Wang等[8]檢測了16對肺鱗癌組織及正常組織的全基因組lncRNA和mRNA表達(dá)水平并利用定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）在47例患者中驗(yàn)證lncRNA表達(dá)水平，共有2 748個上調(diào)探針和852個下調(diào)探針在腫瘤組織中差異表達(dá)顯著。亞組分析發(fā)現(xiàn)，46個和18個lncRNA探針分別在吸煙和中分化腫瘤中特異性差異表達(dá)。Chen等[9]則從GEO下載人類肺癌mRNA和lncRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示，差異表達(dá)的lncRNA靶基因幾乎包含所有來自mRNA的差異表達(dá)基因，并且這些失調(diào)的lncRNA在功能富集方面表現(xiàn)出更全面的損害。

1.4 環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）和mRNA

CircRNA不易被核酸外切酶RNase降解，且具有高度保守性和組織、時序、疾病特異性，從而有望成為潛在的腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[29]。目前circRNA的研究尚處于起步階段，對其功能和機(jī)制尚不明確。circRNA主要作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用[30]，進(jìn)而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平調(diào)控mRNA。Cheng等[10]通過上海生物技術(shù)公司人ceRNA陣列分析，闡明了肺鱗癌circRNA和mRNA的共表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)circTP63顯著上調(diào)FOXM1。通過miRanda預(yù)測發(fā)現(xiàn)circTP63競爭性結(jié)合miR-873-3p，進(jìn)而消除miR-873-3p對靶基因FOXM1的內(nèi)源性抑制作用。

1.5 DNA甲基化、miRNA和mRNA

雖然DNA甲基化和miRNA可分別調(diào)控基因的表達(dá)，但也有研究表明DNA甲基化和miRNA可相互調(diào)控、互為靶向作用，并進(jìn)一步影響其靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞形成。miRNAs的5’調(diào)節(jié)區(qū)的DNA高甲基化是腫瘤中miRNAs表達(dá)沉默的機(jī)制之一[31]。因此，腫瘤中miRNAs的異常甲基化調(diào)控可能是腫瘤成因的新機(jī)制之一，這意味著miRNAs啟動子區(qū)的甲基化對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后同樣具有重要作用。Yang等[32]利用TCGA對肺腺癌的DNA甲基化及mRNA和miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組學(xué)分析，得出PAK1、FGFR2與肺腺癌患者的生存有關(guān)。有研究[12]利用miR-seq發(fā)現(xiàn)miR-224在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中顯著上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)啟動子低甲基化可激活ERK信號通路參與調(diào)控miR-224在NSCLC中的表達(dá)。

1.6 DNA甲基化、lncRNA和mRNA

Feng等[13]對12對非小細(xì)胞肺癌的癌和癌旁組織進(jìn)行了lncRNA、mRNA表達(dá)和DNA甲基化的全基因組分析，表明LOC146880在NSCLC中可能發(fā)揮致癌轉(zhuǎn)錄本的作用。TRANSFAC預(yù)測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SP1能結(jié)合到LOC146880啟動子區(qū)，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響其表達(dá)。該研究同時將表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)起來，更全面地理解lncRNA在非小細(xì)胞肺癌中的作用。Feng等[14]也做過類似分析，識別了非小細(xì)胞肺癌中與lncRNA/mRNA表達(dá)相關(guān)的差異甲基化（DM）位點(diǎn)，評價了非小細(xì)胞肺癌中DNA甲基化和基因表達(dá)以及編碼和非編碼基因之間的同步變化。

1.7 MiRNA、lncRNA/circRNA和mRNA

研究發(fā)現(xiàn)，某些lncRNA、circRNA和premRNA均可發(fā)揮microRNA海綿作用[33]。miRNA與lncRNA之間既可以直接相互作用，也可以通過其他分子（特別是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物）間接影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，揭示miRNA和lncRNA相互作用在腫瘤發(fā)生中的作用可以為腫瘤的診斷和治療提供新思路。Wang等[34]通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析非小細(xì)胞肺癌的癌組織及正常組織間差異表達(dá)的miRNA、lncRNA、mRNA，構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，部分基因可能成為治療NSCLC患者的新靶點(diǎn)，但研究主要方法是生物信息學(xué)技術(shù)，網(wǎng)絡(luò)和功能還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。通過全基因組范圍分析，識別潛在的功能性circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在肝癌[35]、非酒精性脂肪肝[36]等疾病中已見研究，但是三者全基因組范圍的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析在肺癌中尚未見報道。Jin等[15]對肺癌病例和健康對照組的血液樣本進(jìn)行RNA測序，檢測了miRNA、circRNA和mRNA以及l(fā)ncRNA，采用通路富集分析建立以miRNA為目標(biāo)的內(nèi)源性競爭網(wǎng)絡(luò)，篩選重要節(jié)點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，lncRNA/circRNA-miRNAm RNA網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)可能會使我們對癌癥的病因、轉(zhuǎn)移機(jī)制以及潛在的治療靶點(diǎn)有更全面的認(rèn)識。但多分子水平聯(lián)合，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，仍需進(jìn)一步研究。

2 基因組和表觀基因組聯(lián)合

基因組水平的改變在于DNA序列的變化，而表觀基因組水平的改變不涉及DNA序列的變化，這兩個數(shù)據(jù)的整合基礎(chǔ)在于兩者互為因果關(guān)系。

2.1 DNA拷貝數(shù)異常和甲基化

目前，遺傳畸變與表觀遺傳改變二者的結(jié)合機(jī)制尚不清楚；然而，基因損傷與甲基化模式的改變之間似乎既有直接作用，也有間接作用[37]。因此，將遺傳和表觀遺傳變異聯(lián)系起來的圖譜可能被用來識別新的臨床病理標(biāo)志物，用于各種癌癥的診斷和治療。Son等[16]分別比較基因組雜交技術(shù)（array comparative genomic hybridization,aCGH）和甲基化芯片分析的20對非小細(xì)胞肺癌患者癌和非癌組織樣本全基因組范圍內(nèi)的異常DNA拷貝數(shù)和甲基化情況。研究發(fā)現(xiàn)，HOXA9同時具有高甲基化和DNA拷貝數(shù)異常，在癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，并且定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）、甲基化抑制劑 5-氮雜脫氧胞苷（DAC）實(shí)驗(yàn)及pCMV-ACHOXA9轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均與該發(fā)現(xiàn)一致，提示HOXA9可能是肺癌發(fā)病機(jī)制和診斷的潛在候選基因。

2.2 SNP和miRNA/lncRNA

單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms,SNPs）可以改變miRNA的性質(zhì)，從而影響個體對癌癥的易感性。miRNA基因中的SNP被認(rèn)為通過以下三種方式影響其功能：通過初級轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄或通過pri-miRNA和pre-miRNA處理或通過對miRNA-mRNA相互作用的影響[17]。Chin等[18]發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA結(jié)合位點(diǎn)SNP，它可以單獨(dú)預(yù)測中度吸煙史人群中NSCLC風(fēng)險的顯著增加。Pu等[19]的研究進(jìn)一步表明了miRNA相關(guān)多態(tài)性可能通過改變靶基因的miRNA調(diào)節(jié)與NSCLC患者的臨床結(jié)果相關(guān)。另有研究分析miRNA基因多態(tài)性與肺癌遺傳易感性及預(yù)后的關(guān)聯(lián)[20]。lncRNA的SNPs與肺癌遺傳易感性及預(yù)后關(guān)聯(lián)研究也有報道[38]。

3 基因組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合

轉(zhuǎn)錄組測序得到的差異基因表達(dá)譜廣泛用于疾病遺傳基礎(chǔ)研究。但是單獨(dú)使用轉(zhuǎn)錄組測序會遇到很大困難，源于許多差異表達(dá)基因在人群中的個體差異，這些基因和疾病并沒有直接聯(lián)系。通過整合基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為復(fù)雜疾病研究提供了一個新策略。

3.1 DNA拷貝數(shù)變異（CNVs）和mRNA

多水平分子譜的綜合分析可以區(qū)分出在癌癥易感性和轉(zhuǎn)移中基于單一數(shù)據(jù)無法揭示的相互作用。DNA拷貝數(shù)變異（CNVs）是指腫瘤組織中經(jīng)常觀察到的染色體片段的拷貝數(shù)變化。研究表明，CNV可能與某些基因表達(dá)水平的變化有關(guān)[8,11-39]。據(jù)估計，CNVs在基因表達(dá)可遺傳變異中所占的比例大于15%[40]。雖然單獨(dú)使用基因表達(dá)改變已被證明是臨床診斷和預(yù)測的一種精確和可行的工具[41]，但并不一定能揭示分子功能參與癌癥機(jī)制。Iranmanesh等[21]通過對CNV和與預(yù)后相關(guān)的全基因組mRNA表達(dá)的整合分析構(gòu)建的CNV/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為肺癌預(yù)后中潛在的CNV調(diào)控轉(zhuǎn)錄機(jī)制提供了重要的依據(jù)。

3.2 SNP/插入/缺失/重排和mRNA

在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域上的突變會引起氨基酸序列的改變和基因表達(dá)改變。但有研究表明，非蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的SNP重要性不亞于編碼突變[42]。Sereewattanawoot等[22]利用肺腺癌細(xì)胞株進(jìn)行多組學(xué)測序，在被認(rèn)為具有啟動子或增強(qiáng)子功能的區(qū)域也檢測到許多體細(xì)胞SNP。利用結(jié)合位點(diǎn)分析法（ChIP-Seq）和RNA測序，分析調(diào)控區(qū)突變位點(diǎn)及其靶轉(zhuǎn)錄本的突變體和參考等位基因頻率有無差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，137個潛在的調(diào)控區(qū)突變影響了146個RefSeq轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，至少有84個SNV破壞了潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

4 基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合

三個組學(xué)數(shù)據(jù)涉及到多個層面的生物學(xué)過程，涉及大量復(fù)雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需大量的后續(xù)研究。Bjaan?s等[23]綜合分析突變、甲基化和mRNA的相關(guān)數(shù)據(jù)，確定了一個基于DNA甲基化水平的預(yù)后指標(biāo)，可以將患者分為預(yù)后良好或較差的組，為了解癌癥在基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生的異常，Suzuki等[24]進(jìn)行的肺癌綜合多組學(xué)分析的數(shù)據(jù)集為基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組畸變之間相互作用的生物學(xué)解釋提供有價值的基礎(chǔ)。

5 總結(jié)

通過整合多種類型的組學(xué)數(shù)據(jù)以及異質(zhì)性的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)，能夠幫助我們?nèi)娴卣J(rèn)識肺癌發(fā)生發(fā)展各階段分子水平的改變，為治療藥物和靶點(diǎn)及預(yù)后判斷等提供新思路。然而目前仍存在局限性：第一，實(shí)驗(yàn)和技術(shù)方面，對于相同類型的組學(xué)分析，通?？梢允褂枚鄠€技術(shù)平臺，例如，不同制造商的微陣列和測序平臺被用于轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組關(guān)聯(lián)研究，它們通常具有不同的基因組區(qū)域和特征；第二，生物樣本方面，組織和細(xì)胞類型特異性導(dǎo)致了多組研究中組織和細(xì)胞類型的選擇和組織的異質(zhì)性的問題；第三，尋找多組學(xué)之間的關(guān)聯(lián)，對數(shù)據(jù)整合分析方法的研究還需要進(jìn)一步研究；第四，多組學(xué)之間相互聯(lián)系、相互調(diào)控的機(jī)制復(fù)雜，尚待研究。綜上，整合分析多組學(xué)高通量測序數(shù)據(jù)篩選疾病靶點(diǎn)，在科學(xué)理論和技術(shù)操作的層面都需要更加系統(tǒng)深入的研究。