血凝和血凝抑制試驗

陳美艷，羅福斌，任 芬

（1.新平縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南新平 653400；2.新平縣畜牧站，云南新平 653400）

血凝、血凝抑制試驗是目前獸醫(yī)實(shí)驗室用于禽疫苗免疫抗體水平監(jiān)測技術(shù)，也可用已知標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（抗體）監(jiān)測是否有該病毒（抗原）的存在。實(shí)驗室用血凝、血凝抑制試驗檢測雞血清中禽流感和新城疫抗體，其血凝反應(yīng)（HA）可以理解為，禽流感病毒和新城疫病毒或其血凝素能和雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)致使紅細(xì)胞不能自然沉降。血凝抑制反應(yīng)（HI）理解為，當(dāng)禽流感和新城疫工作抗原和血清樣品中抗體反應(yīng)后，則紅細(xì)胞就不能再與工作抗原發(fā)生反應(yīng)，這時紅細(xì)胞就呈現(xiàn)出自然沉降現(xiàn)象，當(dāng)血清樣品抗體不足以和工作抗原反應(yīng)時，工作抗原就和紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試劑

96孔U型微量反應(yīng)板、移液槍及配套滴頭，禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H9亞型陽性血清、陰性血清、體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液、滅菌生理鹽水和加樣槽。

1.2 試驗方法

為避免出現(xiàn)紅細(xì)胞自凝現(xiàn)象，一般選用至少3只健康公雞分別采血，并清洗紅細(xì)胞后配制成體積分?jǐn)?shù)為10%紅細(xì)胞懸液，最后配制成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞懸液。若1%雞紅細(xì)胞懸液用量大于100 mL時也可直接配制。一般按照等比例混勻體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液，如在試驗過程中遇到特殊情況，無法滿足等量比例混合時也可適當(dāng)調(diào)整比例。整個試驗過程只能使用同1份雞紅細(xì)胞懸液，并保持混勻以確保紅細(xì)胞均勻；如有紅細(xì)胞破裂或者被污染情況，試驗無效。

1.2.2 血凝（HA）試驗，即抗原效價

按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行血凝試驗，根據(jù)熟練程度選擇平行測定抗原血凝效價，一般選擇3個平行測定，U型微量反應(yīng)孔反應(yīng)體系為0.075 mL混合液。使用抗原：禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原，批號：2018006，生產(chǎn)日期：20181228，有效期至20201227，生產(chǎn)廠家：哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 4HAU抗原標(biāo)定試驗

選用4單位抗原、2單位抗原、1單位抗原，1/2單位抗原、1/4單位抗原和1組生理鹽水對照進(jìn)行標(biāo)定。U型微量反應(yīng)孔反應(yīng)體系為0.05 mL混合液。

1.2.4 血凝抑制試驗（HI）

按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行血凝抑制試驗，U型微量反應(yīng)孔反應(yīng)體系為0.075 mL混合液。使用陽性血清名稱：禽流感病毒H9亞型陽性血清，批號：2018002，生產(chǎn)日期：20180906，有效期至20200907。生產(chǎn)廠家：哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原血凝（HA）試驗

室溫23 ℃下靜置40 min觀察結(jié)果。圖1、圖2為禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原血凝試驗結(jié)果。

以完全血凝（將反應(yīng)板傾斜時紅細(xì)胞不滑落）的抗原最高稀釋倍數(shù)為一個血凝單位（HAU）為判定標(biāo)準(zhǔn)，該試驗對照孔上層清亮，紅細(xì)胞完全沉降，故將上述抗原血凝的終點(diǎn)滴度判定為1∶512，則4HAU工作抗原的稀釋倍數(shù)為1∶128。同時也配制稀釋倍數(shù)為1∶64 的工作抗原。

全內(nèi)臟反位(Situs Inversus Viscerum)又稱“鏡面人”或“鏡像人”，是指人的心臟、 肝臟、脾臟、膽囊、腎臟、胃、腸等器官的解剖位置與正常人完全相反。此種病例極其罕見，最近本院脊柱外科收治1例“鏡面人”合并腰椎間盤突出癥病例，采用經(jīng)Quadrant通道系統(tǒng)椎間孔腰椎椎間融合術(shù)(Mis-TLIF)治療，現(xiàn)將診治過程報道如下。

2.2 4HAU抗原標(biāo)定試驗

將上述抗原血凝的終點(diǎn)滴度判定為1∶512，4HAU工作抗原的稀釋倍數(shù)為1∶128，即0.1 mL抗原懸液混入12.7 mL生理鹽水中充分混勻。

標(biāo)定結(jié)果如圖3、圖4。4單位抗原、2單位抗原完全凝集，1單位抗原少于85%凝集，1/2單位抗原紅細(xì)胞流淌，判定工作抗原液中抗原稍微偏少，所測血清抗體滴度可能偏高。

將上述抗原血凝的終點(diǎn)滴度判定為1∶256，4HAU工作抗原的稀釋倍數(shù)為1∶64，即0.1 mL抗原懸液混入6.3 mL生理鹽水中充分混勻。

標(biāo)定結(jié)果如圖5、圖6。4單位抗原、2單位抗原、1單位抗原完全凝集，1/2單位抗原約為60%凝集，判定工作抗原液中抗原稍微偏多，所測血清抗體滴度可能偏低。

將1∶128的工作抗原和1∶64的工作抗原進(jìn)行1∶1（5 mL+5 mL）混勻標(biāo)定結(jié)果如圖7、圖8。4單位抗原，2單位抗原，1單位抗原完全凝集，1/2單位抗原約為50%凝集，判定4HAU工作抗原液配制準(zhǔn)確。

2.3 血凝抑制試驗（HI）

本次試驗所測陰性血清滴度小于1 log2，陽性血清滴度大于說明書1個滴度，試驗結(jié)果有效。圖9為本次試驗所測陰性血清滴度，圖10、圖11為所測陽性血清滴度。將反應(yīng)板傾斜時3種4HAU工作抗原所測陽性血清都是第8孔和生理鹽水對照孔中紅細(xì)胞的流淌狀態(tài)一致。

3 結(jié) 論

3.1 抗原血凝的終點(diǎn)滴度判定以紅細(xì)胞不流淌為標(biāo)準(zhǔn)

所配制4HAU工作抗原標(biāo)定時，1單位抗原孔中紅細(xì)胞沒有達(dá)到100%凝集。工作抗原液中抗原稍微偏少，其所測血清抗體滴度可能會偏高。

3.2 抗原血凝的終點(diǎn)滴度判定以紅細(xì)胞出現(xiàn)沉降為標(biāo)準(zhǔn)

所測抗原血凝效價為1∶512，所配制的4HAU工作抗原標(biāo)定時，1/2單位抗原大于50%以上凝集，且1/4單位抗原孔中紅細(xì)胞流淌狀態(tài)沒有達(dá)到生理鹽水對照孔中紅細(xì)胞的流淌標(biāo)準(zhǔn)。判定工作抗原液中抗原稍微偏多，所測血清抗體滴度可能會偏低。

3.3 將兩種工作抗原懸液以1∶1比例混勻后標(biāo)定

4HAU工作抗原液標(biāo)定時完全符合工作抗原標(biāo)定要求。

3.4 將3種工作抗原懸液用于測定禽流感病毒H9亞型陽性血清

其HI滴度完全一致并無差異。