馬洪明， 黃遠(yuǎn)順， 黃妙靈， 張 苗， 陳 洋， 黃志宏，崔 淼， 梁婉玲， 劉升明， 蔡興東△

（1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東廣州510630；2暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510632）

肺癌目前仍然是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致腫瘤性死亡的首要原因［1］。2018年，全球新發(fā)肺癌病例約210萬，死亡病例約180萬［1］。目前男性肺癌患者的發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但在女性中，肺癌的發(fā)病率呈上升并年輕化趨勢(shì)［2-3］。肺癌目前5年累積生存率約為18%，但仍然有一半以上的肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)處于晚期，其5年累積生存率僅為4%左右［4］，主要是由于肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制不清楚，仍需探索相關(guān)治療和預(yù)后預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)。

瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道是一類陽離子通道，參與了機(jī)體多種生理活動(dòng)，其中TRPM8屬于TRPM亞家族，被激活后可引起細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，Ca2+作為第二信使調(diào)控細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、凋亡等生物學(xué)行為。研究表明，TRPM8在前列腺癌［5］、胰腺癌［6］和膀胱尿路上皮癌［7］中高表達(dá)，與患者的不良預(yù)后有關(guān)。TRPM8影響Lewis肺癌細(xì)胞的黏附、移動(dòng)和侵襲能力［8］。但在肺腺癌中TRPM8的表達(dá)及其臨床意義尚無文獻(xiàn)報(bào)道，因此本研究通過檢測(cè)TRPM8在肺腺癌組織中的表達(dá)，分析其與患者臨床特征的關(guān)系，并通過上調(diào)肺腺癌細(xì)胞中TRPM8的表達(dá)分析其對(duì)肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

材料和方法

1 患者臨床資料、組織標(biāo)本收集及分析

1.1 患者組織標(biāo)本、臨床資料收集及隨訪 收集暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院2007～2012年病理確診肺腺癌患者112例，包括75例肺腺癌及匹配的癌旁組織，癌旁組織定義為肺癌切緣外3 cm處肺組織。其中男66例，平均年齡（59.9±10.6）歲，女 46例，平均（59.8±11.1）歲。所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行研究。術(shù)前均未經(jīng)放療及化療，所有患者術(shù)后病理證實(shí)為腺癌或支氣管肺泡癌。根據(jù)國際肺癌研究學(xué)會(huì)肺癌第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，所有患者隨訪至死亡或4～5年。

1.2 組織標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色分析 采用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，分析TRPM8在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá)。HE染色常規(guī)顯示肺實(shí)質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞。兔抗TRPM8多克隆抗體（LifeSpan Biosciences）按 1∶200稀釋，HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG（Boster）。采用SP超敏試劑盒，按照說明書操作，以PBS代替I抗，做空白對(duì)照。免疫組織化學(xué)結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師分別雙盲閱片判定。TRPM8在肺腺癌切片中表達(dá)強(qiáng)度參考文獻(xiàn)［9-10］評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分如下：0分（無染色），1分（輕度染色：淺黃色），2分（中度染色：黃棕色），3分（重度染色：棕色）。染色陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分如下：0分（無染色陽性細(xì)胞），1分（＜10%陽性細(xì)胞），2分（10～50%陽性細(xì)胞），3分（＞50%陽性細(xì)胞）。染色指數(shù)=染色陽性細(xì)胞數(shù)×染色強(qiáng)度，共記為0、1、2、3、4、6和9分。表達(dá)高低的最佳截?cái)嘀祷趌og-rank檢驗(yàn)分析肺腺癌患者病理組織中TRPM8蛋白表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系來界定。其中染色指數(shù)≤4為低表達(dá)，＞4為高表達(dá)。

2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1 通過慢病毒感染上調(diào)A549和H1299細(xì)胞TRPM8表達(dá) 人肺腺癌細(xì)胞A549和H1299購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，以含有10%胎牛血清（Gibco BRL）、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（Gibco BRL）培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，每2 d更換培養(yǎng)液1次。含重組人TRPM8基因（NM_024080.4）慢病毒顆粒及對(duì)照空載體慢病毒顆粒購自吉?jiǎng)P基因，該病毒攜帶篩選基因EGFP及嘌呤霉素。A549及H1299細(xì)胞感染病毒72 h后以10μg/L嘌呤霉素（Sigma）終濃度篩選3周，熒光顯微鏡下可見均帶有EGFP的細(xì)胞，提示篩選成功。篩選成功后提取細(xì)胞總RNA，以T100 PCR儀（Bio-Rad）擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)如下：95℃ 30 s；95℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。TRPM8上游引物序列為5′-GAAAACACCCAACCTGGTCATTTC-3′，下游引物序列為 5′-CACCGTGCGGGGTAAAAAGCG-3′；內(nèi)參照GAPDH上游引物序列為5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，下游引物序列為 5′-TGCTGTTGAAGTCAGAGGAGAC-3′。凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。同時(shí)提取細(xì)胞總蛋白，按KeyGene蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。以10%SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)印于PVDF膜（Milipore）上。然后以5%的脫脂奶粉封閉1小時(shí)，分別剪開PVDF膜（TRPM8，120 kD；GAPDH，45 kD），在4℃冰箱中分別孵育兔抗TRPM8抗體（1∶200，LifeSpan Biosciences）及 GAPDH 抗體（1∶3 000，Boster）過夜，PBST洗膜5次后以HRP交聯(lián)的鼠抗兔II抗（CoWin Biosciences）室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后滴入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色并曝光拍片，保存以備分析。

2.2 CCK-8法及集落形成試驗(yàn) （1）將穩(wěn)定表達(dá)TRPM8蛋白的A549細(xì)胞、空載體細(xì)胞和親本細(xì)胞按每孔8×103個(gè)接種至96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后加入CCK-8（Dojindo），按試劑說明書進(jìn)行操作，每次加入CCK-8試劑1 h后在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀A值。測(cè)定細(xì)胞接種后24、48、72、96、120、144和168 h的A值。（2）將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期上述3組細(xì)胞用0.25%胰酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，按培養(yǎng)皿4×104個(gè)接種培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞形成顯著的細(xì)胞集落后以結(jié)晶紫染色，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，統(tǒng)計(jì)3組細(xì)胞集落數(shù)的差異。

2.3 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 在6孔板背面劃?rùn)M線標(biāo)記，將穩(wěn)定表達(dá)TRPM8蛋白的A549細(xì)胞、空載體細(xì)胞和親本細(xì)胞按每孔8×103個(gè)接種至標(biāo)記6孔板中，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞量達(dá)90%～95%時(shí)，用200μL吸頭及滅菌直尺垂直于6孔板的板底逐個(gè)依次劃痕，吸去舊培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌3次，洗去脫落的細(xì)胞碎片，各孔加入2%高糖培養(yǎng)液3 mL，拍照并記錄為0 h圖像，繼續(xù)培養(yǎng)，間隔8h后再取出拍照，記錄遷移距離，分別記錄為8、16和24 h圖像，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，應(yīng)用ImageJ軟件分析，并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) Transwell小室充分水化2 h，上室分別加入200μL穩(wěn)定表達(dá)TRPM8蛋白的A549細(xì)胞、空載體細(xì)胞和親本細(xì)胞的細(xì)胞懸液（1×108/L），下室加入10%完全培養(yǎng)液500μL，放入原培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出，PBS清洗2次，用棉簽輕輕拭去未穿透的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色液染色15 min，流水緩慢淋洗，室溫晾干，顯微鏡下選擇3個(gè)視野拍照并保存，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè) （1）培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)TRPM8的A549細(xì)胞和空載體A549細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，具體方法參考文獻(xiàn)［11］。記錄細(xì)胞在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm處所得紅色熒光，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，分析不同組在細(xì)胞周期分布中的差異。（2）將上述2組細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以annexin V-FITC及PI雙染色試劑（BD）進(jìn)行染色后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期和晚期凋亡情況，具體方法參考文獻(xiàn)［12］，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.6 C57/BL6N重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 選取5只雌性C57/BL6N重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠，將穩(wěn)定表達(dá)TRPM8的H1299細(xì)胞（H1299-TRPM8）及其對(duì)照空載體細(xì)胞（H1299-control）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用PBS重懸后將100μL含1×107個(gè)細(xì)胞的懸液分別接種至4周大小C57/BL6N小鼠左右臀部皮下，左側(cè)臀部皮下接種H1299-control，右側(cè)臀部皮下接種H1299-TRPM8，繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。待成瘤后用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，每周測(cè)量1次，計(jì)算腫瘤體積（=0.5×長(zhǎng)徑×短徑2），并繪制腫瘤增殖曲線。飼養(yǎng)6周后脫頸處死裸鼠，剝離腫瘤組織并稱重。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。TRPM8蛋白表達(dá)在各臨床參數(shù)之間的差異分析采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA）；兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)分析肺腺癌患者TRPM8不同表達(dá)組累積生存率的差異；單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肺腺癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺腺癌患者腫瘤組織中TRPM8蛋白表達(dá)情況及對(duì)患者預(yù)后的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，TRPM8在肺腺癌及癌旁組織中均有表達(dá)，在肺癌組織中主要定位于癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，而癌旁組織中主要定位于肺泡間質(zhì)巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)中，見圖1?；颊吲R床特征和以染色指數(shù)區(qū)分的TRPM8高、低表達(dá)情況見表1。log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，肺腺癌患者總體生存時(shí)間在TRPM8蛋白不同表達(dá)組存在顯著差異（P=0.017），見圖1F。Kaplan-Meier分析顯示，TRPM8低表達(dá)組患者4～5年累積生存率為37.52%（95%CI：0.241～0.412），TRPM8高表達(dá)組患者4～5年累積生存率為69.82%（95%CI：0.513～0.874）。TRPM8低表達(dá)的患者腫瘤最大徑為（4.29±1.84）cm，而TRPM8高表達(dá)的患者腫瘤最大徑為（3.56±1.60）cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028），見圖1G。

Figure 1.The expression of TRPM8 protein in tumor tissues was correlated with the overall survival time and the tumor size of the patients with lung adenocarcinoma.A～C：strong，moderate and negative immunohistochemical staining of TRPM8 in lung adenocarcinoma tissues，respectively（scale bar=100μm）；D，E：a lung adenocarcinoma tissue section immunostained with PBS（negative control）and TRPM8 antibody，respectively（scale bar=100 μm）；F：the overall survival time of patients with lung adenocarcinoma was significantly different between high and low TRPM8 expression groups（P=0.017）；G：maximum tumor diameter（MTD）of the patients with lung adenocarcinoma was significantly different between high and low TRPM8 expression groups（P=0.028）.Mean±SD.圖1 TRPM8在不同肺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后和腫瘤最大徑的關(guān)系

2 TRPM8表達(dá)與肺腺癌患者臨床特征的關(guān)系

分析TRPM8蛋白表達(dá)在肺腺癌患者臨床參數(shù)之間的差異，結(jié)果顯示，隨著腫瘤T分期的遞增，高表達(dá)TRPM8者呈減少趨勢(shì)（P＜0.05），而M0期高表達(dá)TRPM8者比M1期多（P＜0.05），不同年齡段、性別、分化程度、臨床分期和N分期的TRPM8表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3 TRPM8低表達(dá)是肺腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

單因素Cox回歸分析顯示，TRPM8蛋白表達(dá)水平、臨床病理分期和TNM分期均為影響肺腺癌患者預(yù)后的有意義變量（P＜0.05）；多因素Cox回歸分析顯示，TRPM8蛋白表達(dá)水平和腫瘤是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素：TRPM8低表達(dá)患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)較高表達(dá)TRPM8患者增加2.33倍（95%CI：1.109～4.878，P＜0.05），發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，其死亡風(fēng)險(xiǎn)較未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者高5.32倍（95%CI：1.531～18.490，P＜0.05），見表3。

4 過表達(dá)TRPM8對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響

首先，通過慢病毒感染穩(wěn)定上調(diào)A549細(xì)胞中TRPM8蛋白的表達(dá)，RT-PCR及Western blot顯示成功上調(diào)A549細(xì)胞中TRPM8 mRNA及蛋白的表達(dá)，見圖2A、B。CCK-8法結(jié)果顯示，過表達(dá)TRPM8后，相對(duì)于空載體和親本細(xì)胞組，A549細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01），見圖2C。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)TRPM8后，A549細(xì)胞形成的集落數(shù)較親本和空載體組減少（P＜0.01），見圖2D。

表1 112例肺腺癌患者臨床特征Table 1.The clinical characteristics of 112 patients with lung adenocarcinoma

表2 肺腺癌患者臨床特征與TRPM8表達(dá)的關(guān)系Table 2.The correlation between the TRPM8 protein expression and the clinicopathological characteristics of patients with lung adenocarcinoma

5 過表達(dá)TRPM8對(duì)A549細(xì)胞周期及凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，相對(duì)于空載體組，過表達(dá)TRPM8的A549細(xì)胞S期比例顯著升高（P＜0.01），見圖3A；而過表達(dá)TRPM8的A549細(xì)胞與感染空載體的對(duì)照細(xì)胞的早期及晚期凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖3B。

6 過表達(dá)TRPM8對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)TRPM8的A549細(xì)胞遷移率在劃痕后8 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），在劃痕后16和24 h顯著降低（P＜0.05），而親本和空載體A549細(xì)胞在不同時(shí)點(diǎn)遷移率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

表3 Cox回歸模型單因素和多因素分析肺腺癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素Table 3.The risk factors for poor prognosis of lung adenocarcinoma patients evaluated by univariate and multivariate Cox regression analysis

7 過表達(dá)TRPM8對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同時(shí)間內(nèi)過表達(dá)TRPM8的A549細(xì)胞侵襲數(shù)（121.17±10.97）比親本及空載體A549細(xì)胞（618.17±67.52和529.83±45.50）顯著減少（P＜0.01），見圖5。

8 過表達(dá)TRPM8對(duì)免疫缺陷小鼠H1299細(xì)胞移植瘤的影響

通過慢病毒感染上調(diào)H1299細(xì)胞中TRPM8的表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示TRPM8在H1299細(xì)胞表達(dá)顯著上調(diào)，見圖6A。將H1299細(xì)胞接種于C57/BL6N免疫缺陷小鼠，構(gòu)建移植瘤模型，移植瘤生長(zhǎng)曲線顯示，TRPM8過表達(dá)的H1299細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)速率顯著低于空載體對(duì)照的H1299細(xì)胞移植瘤（P＜0.01），見圖6B、C。處死免疫缺陷小鼠后稱量移植瘤重量，結(jié)果顯示，TRPM8過表達(dá)的H1299細(xì)胞移植瘤重量較對(duì)照組顯著降低（P＜0.01），見圖6B、D。

討 論

我們的研究結(jié)果首次在肺腺癌患者腫瘤組織中證實(shí)TRPM8蛋白的表達(dá)，生存分析結(jié)果顯示肺腺癌中高表達(dá)TRPM8的患者4～5年累積生存率顯著高于TRPM8低表達(dá)的患者，單因素和多因素Cox回歸分析都顯示TRPM8低表達(dá)與腫瘤患者不良預(yù)后有關(guān)，而且TRPM8高表達(dá)者腫瘤直徑更小，T分期更小，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者TRPM8高表達(dá)居多。因從，臨床資料提示肺腺癌高表達(dá)TRPM8似乎是一個(gè)保護(hù)因素，這與其他腫瘤中TRPM8的作用是不一致的。

TRPM8參與了前列腺上皮細(xì)胞增殖和（或）凋亡的調(diào)控，而其表達(dá)受雄激素受體調(diào)控［13］，在雄激素敏感性LNCaP細(xì)胞中高表達(dá)的TRPM8促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，阻斷TRPM8功能或降低TRPM8表達(dá)都能誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡。Liu等［14］發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞TRPM8過表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞遷移，沉默TRPM8基因抑制高侵襲性乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Wang等［15］發(fā)現(xiàn)，人骨肉瘤中TRPM8表達(dá)增加，并與骨肉瘤細(xì)胞的增殖和移動(dòng)有關(guān)。這些研究顯示TRPM8促進(jìn)了腫瘤的增長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。我們研究顯示TRPM8在肺腺癌患者腫瘤組織表達(dá)，高表達(dá)者預(yù)后好，提示其作為抑癌基因起作用，與其在前列腺癌，乳腺癌及骨肉瘤中的研究不同，具體機(jī)制不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，早期前列腺癌為雄激素依賴性，TRPM8表達(dá)增加，隨著癌轉(zhuǎn)化為雄激素非依賴性，TRPM8表達(dá)降低，前列腺癌惡化進(jìn)展、轉(zhuǎn)移，預(yù)后變差［16］。在雄激素非依賴的前列腺癌細(xì)胞PC-3中上調(diào)TRPM8的表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯，抑制與腫瘤黏附能力相關(guān)的酶［17］。這提示TRPM8在不同腫瘤組織的作用不同，在前列腺癌中可能與激素存在與否相關(guān)。但在肺腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)雄激素受體在不同性別之間表達(dá)無顯著差異，且雄激素受體的表達(dá)高低與患者的預(yù)后無顯著相關(guān)性［18］，因而TRPM8的表達(dá)是否受到雄激素的調(diào)控目前還不清楚，需要進(jìn)一步研究。

Figure 2.The effects of TRPM8 protein on the proliferation of A549 cells.The A549 cells were infected with lentivirus containing mock vector or TRPM8 cDNA vector.A：the TRPM8 mRNA expression was detected by RT-PCR；B：the TRPM8 protein expression was detected by Western blot；C：CCK-8 assay showed that overexpression of TRPM8 in A549 cells inhibited the viability of the cells；D：colony formation assay showed that overexpression of TRPM8 in A549 cells inhibited the colony-forming ability of the cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.01 vs A549 group or A549 empty control group.圖2 CCK-8法及集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRPM8蛋白對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響

為了進(jìn)一步探討TRPM8在肺腺癌中的作用，我們選取肺腺癌A549細(xì)胞株，采用含重組人TRPM8基因慢病毒顆粒感染A549細(xì)胞，上調(diào)TRPM8表達(dá)。CCK-8法及集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，過表達(dá)TRPM8后，A549細(xì)胞增殖能力下降。流式細(xì)胞術(shù)分析過表達(dá)TRPM8后，A549細(xì)胞S期比例顯著升高，凋亡無顯著變化，提示過表達(dá)TRPM8導(dǎo)致增殖能力下降可能是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞S期阻滯所致，而非通過影響凋亡途徑。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)TRPM8后，A549細(xì)胞移動(dòng)能力下降。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)TRPM8后，A549細(xì)胞侵襲能力下降。而在胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞中，沉默TRPM8表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤的遷移能力，激活TRPM8則抑制其遷移能力［19］，與我們的研究結(jié)果一致，提示TRPM8抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。為了觀察上調(diào)TRPM8對(duì)肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的整體影響，我們采用免疫缺陷小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，觀察TRPM8對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)TRPM8后，H1299細(xì)胞所形成腫瘤的生長(zhǎng)速率較對(duì)照組顯著下降，腫瘤重量較對(duì)照組顯著降低。與Zhu等［20］在PC-3前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)TRPM8抑制裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這些研究結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)TRPM8會(huì)影響了肺腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。

Figure 3.The effects of overexpression of TRPM8 protein on the cell cycle and apoptosis in A549 cells.A：flow cytometry analysis for cell cycle of A549 cells；B：the apoptosis of A549 cells was detected by flow cytometry with annexin V and PI staining，and the early and late apoptotic rates were calculated.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs A549-empty control group.圖3 上調(diào)A549細(xì)胞中TRPM8的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響

Figure 4.The effects of TRPM8 on the migration ability of A549 cells detected by cell scratch test.Mean±SD.n=3.*P＜0.01 vs A549-empty control group.圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)A549細(xì)胞中TRPM8表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 5.The effects of TRPM8 on the invasiveness of A549 cells.Scale bar=50 μm.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs A549-empty control group.圖5 TRPM8對(duì)各組A549細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 6.The effects of TRPM8 on the growth and weight of H1299 cell-derived xenograft tumor in C57/BL6N immunodeficient mice.A：Western blot analysis showed that TRPM8 was stably up-regulated in H1299 cells；B：H1299 cell-derived xenograft tumors in C57/BL6N immunodeficient mice and the isolated tumors；C：the tumor growth curves；D：the tumor weight.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs H1299-control group.圖6 TRPM8對(duì)C57/BL6N免疫缺陷鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

但肺腺癌TRPM8表達(dá)的變化及調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的具體機(jī)制尚不清楚。前列腺癌TRPM8的表達(dá)受雄激素受體調(diào)控［13］。隨著癌轉(zhuǎn)化為雄激素非依賴性，TRPM8表達(dá)降低［16］。TRPM8在乳腺癌中的表達(dá)和功能受雌激素受體α調(diào)控［21］。似乎性激素參與了TRPM8的表達(dá)和功能，但我們的結(jié)果顯示肺腺癌患者TRPM8表達(dá)與性別無關(guān)，亞組生存分析也顯示在男性和女性患者中，高表達(dá)TRPM8預(yù)后均優(yōu)于低表達(dá)TRPM8的肺腺癌患者，二者之間無顯著差異（資料未提供）。Asuthkar等［22］研究顯示，TRPM8啟動(dòng)子上存在P53結(jié)合位點(diǎn)，過表達(dá)P53增加TRPM8的表達(dá)，TRPM8可能是P53的下游基因。而作為陽離子通道的TRPM8，激活會(huì)引起Ca2+內(nèi)流，Ca2+作為第二信使調(diào)控細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為，可能是其作用機(jī)制。

總之，本研究在人肺腺癌組織探討TRPM8表達(dá)的意義：TRPM8高表達(dá)的患者4～5年累積生存率顯著高于TRPM8低表達(dá)的患者，TRPM8低表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在肺腺癌A549細(xì)胞過表達(dá)TRPM8抑制了其增殖、遷移和侵襲能力；上調(diào)肺腺癌H1299細(xì)胞中TRPM8蛋白表達(dá)抑制其移植瘤的生長(zhǎng)。但肺腺癌中TRPM8的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。