陳 希， 崔毅峙， 王 通△

（1暨南大學(xué)生命與健康工程研究院，廣東廣州510632；2東莞微量精準(zhǔn)檢測研究院，廣東東莞523808）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染所致的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是全球重大的公共衛(wèi)生問題［1］。CHB難以治愈，患者面臨較高停藥后病毒反彈的風(fēng)險(xiǎn)［2］，其主要原因是HBV遺傳物質(zhì)會以共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）形式存在于肝細(xì)胞核中，形成難以清除的HBV病毒儲存庫［3-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，約有20%～30%的CHB患者在體內(nèi)仍有HBV抗原的情況下，停藥后未出現(xiàn)病毒反彈，從而形成了CHB功能性治愈的研究方向和領(lǐng)域。功能性治愈即在患者外周血中檢測不到病毒抗原和核酸的情況下，允許cccDNA的存在，但要處于靜默狀態(tài)［5-6］。

HBV cccDNA至少可轉(zhuǎn)錄出4種HBV RNA，按堿基長度分別被命名為0.7 kb、2.1 kb、2.4 kb和3.5 kb HBV RNA［3-4］，其中血清中 HBV RNA 主要以3.5 kb的前基因組RNA（pre-genomic RNA，pgRNA）為主［7］。最新的專家共識表明，血清HBV RNA，尤其是HBV pgRNA可反映肝內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄活性，并對多種HBV抗原的臨床變化有顯著的預(yù)后作用［7-10］。除了HBV pgRNA，HBV還可編碼一種微小RNA（microRNA，miR），即HBV miR-3，后者通過靶向降低HBV pgRNA和病毒核心抗原的表達(dá)而抑制病毒的復(fù)制［11］。HBV miR-3還可在CHB患者血漿中被檢測出，在急性期患者血漿中含量顯著高于恢復(fù)期的病人［11］。

雖然Yang等［11］利用莖環(huán)引物和SYBR Green染料對HBV miR-3進(jìn)行了半定量檢測，但是該方法基于與宿主miR-16的相對定量，并且未能報(bào)道其靈敏性和特異性。HBV miR-3的檢測方法學(xué)目前尚不成熟。因此，本研究擬通過廣泛篩選特異性引物探針組來建立精準(zhǔn)絕對定量檢測HBV miR-3的方法。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞系 Hep3B細(xì)胞（攜帶HBV基因組）和HepG2細(xì)胞（HBV陰性）均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、丙酮酸鈉、磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、胰蛋白酶、Taq-ManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan Universal Master MixⅡ（2×，no UNG）及合成引物均購自Thermo Fisher Scientific；HBV miR-3寡序列標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC純化級別）購于TaKaRa；SsoAdvancedTMUniversal SYBR?Green Supermix購自Bio-rad；miR-cute miRNA提取分離試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。PCR儀購自東勝龍；StepOne Plus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自Thermo Fisher Scientific。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hep3B及HepG2細(xì)胞均以完全DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，完全DMEM培養(yǎng)液含10%FBS、1 mmol/L 丙酮酸鈉、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10 mg/L環(huán)丙沙星。細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)的序列在PrimerSelect進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，序列5'端和3'端能互補(bǔ)配對形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，接著我們在莖環(huán)序列的3'端加入與目標(biāo)miRNA 5'端互補(bǔ)配對的核苷酸，再利用PrimerSelect進(jìn)行引物二級結(jié)構(gòu)分析，3'端能穩(wěn)定暴露出與miRNA相匹配片段的為合適的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物。

2.3 miRNA提取 細(xì)胞miRNA提取使用miRcute miRNA提取分離試劑。細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用完全DMEM培養(yǎng)液重懸，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取約106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行裂解提取miRNA。步驟簡介如下：離心沉淀細(xì)胞后加入裂解液MZ，在渦旋儀上充分渦旋混勻，室溫孵育5 min。加入200μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫孵育5 min。于4℃、13 400×g離心15 min。吸取上層約500μL溶液轉(zhuǎn)移至新EP管。緩慢加入215μL無水乙醇，混勻后加至吸附柱miRspin，室溫13 400×g離心30 s，保留流出液。吸取600μL流出液于新EP管，加入450μL體積無水乙醇，加至吸附柱miRelute，室溫13，400×g離心 30 s，每次均棄流出液，保留吸附柱。吸附柱依次經(jīng)去蛋白液MRD和漂洗液RW洗滌離心棄廢液后，加入RNase-free water洗脫miRNA。

2.4 miRNA逆轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中包含10倍濃度梯度稀釋的HBV miR-3標(biāo)準(zhǔn)品樣品，儲液濃度為6.02×1015copies/L（下文以E加數(shù)字代表樣品拷貝數(shù)的數(shù)量級），根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求用RNase-free ddH2O進(jìn)行稀釋，設(shè)置陰性對照NTC（no template control）。逆轉(zhuǎn)錄體系為15 μL，其中樣品5μL，逆轉(zhuǎn)錄引物工作濃度為80 nmol/L，其他試劑及其用量按說明書推薦使用。逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋罕戏跤? min，16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存。

2.5 SYBR Green法qPCR 使用SsoAdvancedTMUniversal SYBR?Green Supermix（2×）試劑盒。qPCR體系為20μL，其中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，前引物（forward primer，F(xiàn) primer）工作濃度為1.5 μmol/L，后引物（reverse primer，R primer）工作濃度為0.7μmol/L，其他試劑及其用量按說明書推薦使用。qPCR程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序按照StepOne Plus儀器內(nèi)部設(shè)定。

2.6 TaqMan MGB探針法qPCR 使用TaqMan Universal Master MixⅡ（2×，no UNG）試劑盒。qPCR體系為20μL，其中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，前引物（F primer）的工作濃度為1.5μmol/L，后引物（R primer）的工作濃度為0.7μmol/L，TaqMan MGB探針工作濃度為0.2μmol/L，其他試劑及其用量按說明書推薦使用。qPCR程序?yàn)椋?5℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品樣品濃度進(jìn)行以10為底的對數(shù)轉(zhuǎn)化，再與相對應(yīng)的Ct值進(jìn)行最小二乘法線性擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算決定系數(shù)R2，并計(jì)算擴(kuò)增效率Eff%=［10^（-1/slope）-1］×100%。

結(jié) 果

1 Yang等［11］報(bào)道的方法存在非特異擴(kuò)增

為了驗(yàn)證Yang等［11］所報(bào)道方法的特異性及靈敏度，我們首先重復(fù)了該實(shí)驗(yàn)。樣品為人工合成的HBV miR-3標(biāo)準(zhǔn)品，10倍濃度梯度范圍設(shè)置從E6到E1，陰性對照為NTC和H2O。

HBV miR-3標(biāo)準(zhǔn)品在濃度范圍為E6～E3時(shí)，擴(kuò)增曲線在濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品能區(qū)分開，而在E2和E1濃度下時(shí)，擴(kuò)增曲線與陰性對照NTC和H2O大致重疊（圖1A）。HBV miR-3標(biāo)準(zhǔn)品在E6～E3濃度范圍內(nèi)時(shí)，熔解曲線為單峰曲線（圖1B中黑色曲線），熔解溫度約85℃，說明HBV miR-3標(biāo)準(zhǔn)品在該濃度范圍下擴(kuò)增產(chǎn)物單一。而陰性對照NTC與H2O有熔解峰（圖1B紅色與藍(lán)色曲線），當(dāng)HBV miR-3標(biāo)準(zhǔn)品在E2和E1濃度下時(shí)，熔解曲線出現(xiàn)雜峰（圖1C黑色曲線）。

2 SYBR Green法篩選出特異性較好的引物組

為了實(shí)現(xiàn)對HBV miR-3的微量精準(zhǔn)定量，本研究基于莖環(huán)引物RT-qPCR方法的原理，針對HBV miR-3序列設(shè)計(jì)特異性的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和熒光定量PCR引物（序列見表1），并使用SYBR Green法對引物進(jìn)行測試。

其中KEY和T1～T6為文獻(xiàn)報(bào)道的莖環(huán)，C1～C18為自行設(shè)計(jì)的莖環(huán)，區(qū)別是莖環(huán)部分的序列不同。對引物組進(jìn)行測試，篩選條件為：陽性對照Hep3B細(xì)胞熔解峰與標(biāo)準(zhǔn)品重疊（“+”表示），陽性對照Hep3B熔解峰單一（“+”表示）；以總循環(huán)數(shù)40減去陰性對照NTC與H2O的Ct值所得的值來衡量陰性對照非特異干擾情況，值越小表示非特異干擾越小。根據(jù)以上條件對所有引物組進(jìn)行排列，結(jié)果匯總于表2，其中表現(xiàn)較佳引物組和較差引物組的代表性溶解曲線分別見圖2A、B。

接著我們選擇了排列前6套引物組，進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異性TaqMan MGB探針（序列見表3），以提高敏感性和特異性。

Figure 1.Non-specific amplification was found while using methods reported by Yang et al［11］ to measure HBV miR-3.A：the amplification curves（the black curves from left to right are standards from E6 to E1，respectively）；B，C：the melting curves（the black curves in B are gradient standards from E6 to E3，and the black curves in C are gradient standards from E2 to E1）.The red and blue curves represent the negative controls of NTC（no template control）and H2O，respectively.圖1 Yang等［11］報(bào)道的方法在檢測HBV miR-3時(shí)存在非特異擴(kuò)增

3 確定具有高敏感性和特異性的定量檢測HBV miR-3標(biāo)準(zhǔn)品的引物探針組

為了測試引物探針的特異性及靈敏度，本研究使用10倍濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品（范圍從E8到E1）、陰性對照NTC和H2O。結(jié)果如圖3所示，左側(cè)為擴(kuò)增曲線圖，右側(cè)為擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。其中C5的陰性對照NTC和H2O無擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)品的線性擴(kuò)增范圍為E4～E8，擴(kuò)增效率僅68.4%，標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2為0.989（圖3A）。C7的陰性對照NTC和H2O無擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)品的線性定量范圍為E3～E8，擴(kuò)增效率為94.2%，標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2為0.985（圖3B）。C18的陰性對照NTC和H2O無擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)品的線性定量范圍為E3～E7，決定系數(shù)R2為0.998，擴(kuò)增效率為90.8%（圖3C）。KEY的陰性對照NTC和H2O無擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)品的線性定量范圍為E2～E8，決定系數(shù)R2為0.997，擴(kuò)增效率為88.0%（圖3D）。T3的陰性對照NTC和H2O無擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)品的線性定量范圍E3～E8，決定系數(shù)R2為0.992，擴(kuò)增效率為86.5%（圖3E）。T5的陰性對照NTC出現(xiàn)了非特異擴(kuò)增（圖3F），雖然該組引物在標(biāo)準(zhǔn)品樣品上表現(xiàn)良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍在E2～E8，擴(kuò)增效率（94%）較KEY高，但特異性沒KEY好。綜合以上各套引物在標(biāo)準(zhǔn)品中的定量結(jié)果，我們認(rèn)為KEY是用于HBV miR-3定量檢測的最佳引物，檢測的特異性和靈敏度均在設(shè)計(jì)的引物中表現(xiàn)最好（圖3D）。

表1 引物序列信息Table 1.List of primer sequences

表2 SYBR Green法中各引物組表現(xiàn)匯總Table 2.Performance of primer sets in SYBR Green qPCR

Figure 2.Screening of specific primers using SYBR Green method for specific measurement of HBV miR-3.Representative melting curves that are acceptable and unacceptable are shown in A and B，respectively.圖2 HBV miR-3特異性引物SYBR Green法篩選

表3 TaqMan MGB探針序列信息Table 3.List of TaqMan MGB probe sequences

Figure 3.Screening of specific primer-probes for specific and sensitive measurement of HBV miR-3.A～F：the standard curves of C5，C7，C18，KEY，T3 and T5，respectively.The red dot in F represents the NTC（no template control）.圖3 HBV miR-3特異性高靈敏引物探針組中的篩選

4 在細(xì)胞系內(nèi)驗(yàn)證HBV-miR-3新引物探針組的表現(xiàn)

本研究對HBV陽性的Hep3B細(xì)胞和HBV陰性的HepG2細(xì)胞提取的miRNA進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示，C5和C7兩套引物Hep3B細(xì)胞中HBV miR-3的Ct值接近40，可認(rèn)為未檢出。C18、KEY、T3和T5均能檢測出Hep3B細(xì)胞中的HBV miR-3，Ct值最低為27（在T3中），最高為31（在C18中），且陰性對照RT-free均無擴(kuò)增。在陽性對照能被順利檢測出的幾套引物中，對于HepG2細(xì)胞樣品，在C18中未檢出，在其余幾套中有非特異檢出，其中KEY引物探針組在HepG2細(xì)胞中的Ct值約為37，在Hep3B細(xì)胞中的Ct值約為29，仍然表現(xiàn)出良好的特異性和敏感性。

Figure 4.Measurement of HBV miR-3 in cell lines using the 6 sets of primers with TaqMan MGB probes.Different primer-probe sets were tested for measuring HBV miR-3 in HBV-positive Hep3B cells and HBV-negative HepG2 cells.Each bar showed mean Ct value of 2 independent experiments.圖4 新引物探針組在細(xì)胞系中定量檢測HBV miR-3的情況

討 論

本研究通過重復(fù)了HBV miR-3發(fā)現(xiàn)者Yang等［11］在文獻(xiàn)中使用的相對定量法方法，顯示該SYBR Green法存在較為明顯的非特異擴(kuò)增?；谇o環(huán)引物探針RT-qPCR方法，本研究綜合評價(jià)了多個(gè)莖環(huán)包括Yang等［12］改進(jìn)的key-like莖環(huán)（即KEY）、Feng等［13］使用的莖環(huán)和根據(jù)莖環(huán)設(shè)計(jì)原理［14］自主設(shè)計(jì)的18個(gè)通用莖環(huán)，進(jìn)而利用以上莖環(huán)，針對HBV miR-3序列設(shè)計(jì)特異性逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物。雖然設(shè)計(jì)的原理相同，研究表明不同的莖環(huán)引物及其qPCR引物對有較大差異。結(jié)合TaqMan MGB探針測試，確定了一套靈敏度和特異性最佳的引物探針組KEY，成功建立了一套HBV miR-3微量、特異的絕對定量方法，為后續(xù)研究HBV miR-3的生物學(xué)功能和臨床意義奠定了重要基礎(chǔ)。

目前miRNA的定量檢測方法有很多，如傳統(tǒng)的Northern blotting、microarray、莖環(huán)引物探針RT-qPCR技術(shù)等，還有基于等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、納米技術(shù)等新興技術(shù)［15］。但是，綜合考量各種方法的靈敏度、特異性、成熟度、方便程度等，目前應(yīng)用最廣的為莖環(huán)引物探針RT-qPCR技術(shù)［14］。

本研究進(jìn)行SYBR Green實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在目標(biāo)miRNA濃度較高時(shí)，特異性往往好，在濃度低時(shí)，目標(biāo)miRNA在梯度間往往區(qū)分不開；且從熔解曲線看，低濃度樣品與陰性對照會出現(xiàn)非特異的產(chǎn)物峰。因此，對于豐度比較高的miRNA，我們認(rèn)為SYBR Green法進(jìn)行相對定量仍是較好的方法，但也要進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和PCR條件優(yōu)化以盡量減少非特異性干擾。例如，有研究者把使用SYBR Green法的qPCR循環(huán)數(shù)降低到35，以排除非特異擴(kuò)增干擾［16］。Feng等［13］使用設(shè)計(jì)的幾個(gè)莖環(huán)引物，結(jié)合SYBR Green法建立一套檢測番茄在病毒感染后的多個(gè)miRNA變化的方法，但其擴(kuò)增效率均高于100%，說明其中存在非特異干擾。

如本文前言所述，HBV感染的問題主要在療效評估，這就需要我們對治療后殘留的病毒核酸能夠準(zhǔn)確定量，SYBR Green法在這種需求上有局限性。本文所報(bào)道的方法是針對HBV miR-3的首個(gè)引物探針法，并且達(dá)到了極低的定量檢出限和標(biāo)準(zhǔn)曲線動態(tài)范圍（E2～E8），同時(shí)在維持高擴(kuò)增效率的同時(shí)保證了特異性。而SYBR Green法的定量檢出限僅在E4～E3水平，靈敏度比我們報(bào)道的KEY引物探針組低了近100倍。本研究的結(jié)果也展示了SYBR Green法在檢測HBV miR-3中的非特異性檢出問題較突出。

即使都使用引物探針法，不同引物探針組的表現(xiàn)也不盡相同。我們認(rèn)為，這可能與莖環(huán)引物的特性有關(guān)。例如，由Yang等［12］設(shè)計(jì)的key-like莖環(huán)在莖的部分只有4對CG堿基進(jìn)行互補(bǔ)配對，環(huán)的部分有27個(gè)堿基，環(huán)中有4對間隔的堿基互補(bǔ)配對，是莖環(huán)結(jié)構(gòu)能夠形成的原因，但其ΔG約為-6.3 kcal/mol，整體穩(wěn)定性較Chen等［14］設(shè)計(jì)的莖環(huán)（ΔG約為-22.6 kcal/mol）弱。其前后引物和探針設(shè)計(jì)的方法與Chen等［14］不同，前引物全部為miRNA序列，后引物為莖環(huán)特異序列，探針設(shè)計(jì)跟在前引物之后，只有3個(gè)堿基屬于miRNA。該設(shè)計(jì)理論上存在的問題是，逆轉(zhuǎn)錄引物會與探針結(jié)合，前引物的熔解溫度無法通過5'端突出部分進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)限制條件比較多，從其結(jié)果看，陰性對照NTC也會出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此我們選擇以Chen等［14］的原理設(shè)計(jì)后續(xù)的qPCR前后引物及探針，結(jié)果消除了陰性對照的非特異干擾。較弱的莖環(huán)穩(wěn)定性也使其在進(jìn)行qPCR定量時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)易于打開，從而提高了檢測效率，由于序列本身較短，也不易產(chǎn)生非特異干擾。

綜上所述，基于莖環(huán)引物探針RT-qPCR定量檢測miRNA的方法，我們設(shè)計(jì)并評價(jià)了一套靈敏度和特異性的引物探針組KEY，成功建立了HBV miR-3微量、特異的絕對定量方法。該方法有望為HBV感染的療效評估提供新手段和新指標(biāo)。