張?jiān)聲裕?李 萍， 李炳慶， 陳 健

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北承德067000）

食管癌（esophageal cancer，EC）是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國是食管癌高發(fā)國家，其發(fā)病率及死亡率均居世界第1位，5年生存率僅為15%～34%，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。手術(shù)治療為主，放化療和生物治療為輔是目前癌癥治療的主要方案，但由于食管癌早期癥狀不明顯，確診時(shí)多已進(jìn)入中晚期，因此多數(shù)只能采用化療為治療手段，但化療藥物價(jià)格昂貴，易產(chǎn)生耐藥性且毒副作用大，效果不理想，因此尋找廉價(jià)、毒副作用小的抗腫瘤藥物迫在眉睫［2］。辛伐他汀（simvastatin，SIM）屬于他汀類家族藥物，對心血管疾病的預(yù)防及治療效果顯著，還可防治腫瘤，抑制子宮內(nèi)膜癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡［3-5］。NF-κB通路是一條炎癥相關(guān)信號通路，可調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、凋亡及炎癥和免疫應(yīng)答等生理病理反應(yīng)。NF-κB是該通路中關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB家族中以RelA（p65）研究最為深入［6］。研究報(bào)道，SIM可通過調(diào)節(jié)SIRT2/NF-κB信號通路改善急性肺栓塞大鼠低氧血癥并減輕其炎癥反應(yīng)，可通過上調(diào)NF-κB p65表達(dá)降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［7-8］，還可聯(lián)合NF-κB信號通路抑制劑促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用［9］，但SIM對食管癌細(xì)胞的作用尚鮮有研究。因此本研究擬探究SIM對食管癌Eca109細(xì)胞增殖及NF-κB p65通路的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

材料和方法

1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器

食管癌Eca109細(xì)胞系（ATCC）；辛伐他汀（上海源葉生物科技有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco；亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞核與胞漿蛋白抽提試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）和MTT試劑盒（Sigma）；兔源NF-κB p65和IκB-α抗體（Abcam）；兔源GAPDH、c-Myc抗體、鼠源cyclin D1抗體、IL-6 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、羊抗兔Ⅱ抗、羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG（Invitrogen）。MODEL550型酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；IX73倒置熒光顯微鏡（Olympus）等。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物制備 將食管癌Eca109細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%FBS、1%青-鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化食管癌Eca109細(xì)胞進(jìn)行傳代。用0.1%DMSO溶解SIM定容至50μmol/L，-20℃儲存?zhèn)溆茫幚砑?xì)胞時(shí)采用含0.1%DMSO的生長培養(yǎng)基稀釋。

2.2 MTT法檢測食管癌Eca109細(xì)胞活力 將對數(shù)期食管癌Eca109細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，接種密度約每孔5×104個(gè)，每孔添加培養(yǎng)液200μL。細(xì)胞完全貼壁后更換培養(yǎng)基并添加終濃度為2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L和32μmol/L的SIM處理，另設(shè)無任何添加的食管癌Eca109細(xì)胞為正常對照組（normal control，NC）組，每組6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后用MTT試劑盒檢測各孔細(xì)胞活力，具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。細(xì)胞活力抑制率（%）=（1-ASIM組/ANC組）×100%。

2.3 平板集落形成實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)期食管癌Eca109細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后以每孔200個(gè)接種于6孔板，12 h貼壁后更換培養(yǎng)基并添加終濃度為8μmol/L、16μmol/L和32μmol/L的SIM處理48 h，另設(shè)NC組，每組6個(gè)復(fù)孔。放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，直至出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞集落。甲醛固定后，瑞士染色液染色，隨機(jī)選取5個(gè)視野，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞數(shù)＞50個(gè)的平均細(xì)胞團(tuán)數(shù)作為集落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次（%）。平板集落形成率（%）=（平均集落數(shù)/每孔加入單細(xì)胞數(shù)）×100%。

2.4 Western blot檢測食管癌Eca109細(xì)胞中cyclin D1、c-Myc及p65、IκB-α蛋白的表達(dá) 收集方法2.3中各組食管癌Eca109細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明分別提取細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白，測定蛋白濃度后，置于-80℃保存?zhèn)溆?。?0μg蛋白樣品行6%SDSPAGE分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的I抗（cyclin D1、c-Myc和IκB-α抗體均1∶200，NF-κB p65抗體1∶200，GAPDH抗體1∶500）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次20 min，適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，洗膜，顯色，曝光壓片，觀察結(jié)果并進(jìn)行分析。

2.5 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的水平 具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。檢測重復(fù)4次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。食管癌Eca109細(xì)胞活力抑制率、集落形成率及各蛋白含量為計(jì)量資料，符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SIM對食管癌Eca109細(xì)胞活力的影響

與NC組比較，0.1%DMSO對食管癌Eca109細(xì)胞活力的抑制作用較小，且各時(shí)點(diǎn)抑制率比較無顯著差異（P＞0.05）；2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L和16μmol/L SIM抑制食管癌Eca109細(xì)胞活力的作用呈濃度及時(shí)間依賴性增加（P＜0.05），同一時(shí)間，16μmol/L和32μmol/L SIM對食管癌Eca109細(xì)胞活力的抑制率無顯著差異（P＞0.05）。16μmol/L SIM作用食管癌細(xì)胞48 h其活力抑制率為50.61%，表明此濃度接近半數(shù)抑制濃度（IC50），因此選用8、16和32μmol/L濃度及48 h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件。詳見表1。

表1 不同濃度SIM對食管癌Eca109細(xì)胞活力的影響Table 1.The effects of different concentrations of SIM on viability of esophageal carcinoma Eca109 cells（Mean±SD.n=6）

2 SIM對食管癌Eca109細(xì)胞平板集落形成率的影響

與NC組比較，SIM 8μmol/L和16μmol/L處理組食管癌Eca109細(xì)胞平板集落形成率依次減少（P＜0.05），SIM 16μmol/L和32μmol/L處理組食管癌Eca109細(xì)胞平板集落形成率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖1、表2。

Figure 1.The effect of SIM on flatbed colony formation rate of esophageal carcinoma Eca109 cells.圖1 SIM對食管癌Eca109細(xì)胞平板集落形成率的影響

3 SIM對食管癌Eca109細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白cyclin D1和c-Myc蛋白的影響

與NC組比較，SIM 8μmol/L和16μmol/L處理組食管癌Eca109細(xì)胞中cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），SIM 16μmol/L和32μmol/L處理組食管癌Eca109細(xì)胞cyclin D1和c-Myc蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表2。

Figure 2.The expression of cyclin D1 and c-Myc in Eca109 cells detected by Western blot.圖2 Western blot檢測食管癌Eca109細(xì)胞cyclin D1和c-Myc蛋白的表達(dá)

4 SIM對食管癌Eca109細(xì)胞NF-κB p65通路相關(guān)蛋白的影響

與NC組比較，SIM 8μmol/L和16μmol/L處理組食管癌Eca109細(xì)胞上清中胞核p65蛋白表達(dá)依次減少，胞漿p65蛋白和IκB-α蛋白表達(dá)依次增加（P＜0.05），SIM 16μmol/L和32μmol/L處理組食管癌Eca109細(xì)胞胞漿、胞核p65和IκB-α蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖3、表3。

表2 SIM對食管癌Eca109細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)和集落形成率的影響Table 2.The effects of SIM on the expression of proliferation-related proteins cyclin D1 and c-Myc and the colony formation rate of esophageal cancer Eca109 cells（Mean±SD.n=6）

表3 SIM對食管癌Eca109細(xì)胞NF-κB p65通路相關(guān)蛋白的影響Table 3.The effects of SIM on NF-κB p65 pathway related proteins in esophageal carcinoma Eca109 cells（Mean±SD.n=6）

5 SIM對食管癌Eca109細(xì)胞TNF-α和IL-6水平的影響

與NC組比較，SIM 8μmol/L和16μmol/L處理組食管癌Eca109細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6水平依次減少（P＜0.05），SIM 16μmol/L和32μmol/L處理組食管癌Eca109細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

討 論

大量研究證實(shí)，辛伐他汀參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生理過程，在腫瘤防治中發(fā)揮重要作用。Buranrat等［10］研究報(bào)道，SIM可通過線粒體途徑促進(jìn)人膽管癌CAA細(xì)胞凋亡，抑制其遷移。Wang等［11］研究報(bào)道，SIM可通過上調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞p27和p21表達(dá)抑制STAT3/SKP2軸，激活A(yù)MPK通路，誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞G0/G1期阻滯，抑制其增殖。金迎迎等［12］研究報(bào)道，SIM可通過抑制PI3K/AKT通路，抑制放療引發(fā)的食管癌EC9706細(xì)胞上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，增加食管癌EC9706細(xì)胞的放療敏感性，抑制其增殖、降低其集落存活分?jǐn)?shù)，促進(jìn)其凋亡。c-Myc基因在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，cyclin D1蛋白是一種G1/S特異性周期蛋白，在惡性腫瘤中高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及惡變。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，SIM可顯著抑制食管癌Eca109細(xì)胞增殖，減少其集落形成率，下調(diào)cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)，提示SIM可能通過下調(diào)cyclin D1和c-Myc蛋白抑制食管癌Eca109細(xì)胞增殖。

表4 SIM對食管癌Eca109細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6水平的影響Table 4.The effects of SIM on TNF-α and IL-6 levels in culture supernatant of esophageal carcinoma Eca109 cells（Mean±SD.n=6）

NF-κB p65是NF-κB通路中重要轉(zhuǎn)錄子，可與基因啟動子或增強(qiáng)子特異性結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄。NF-κB家族包括RelA（p65）、c-Rel、RelB、NF-κB1（p50/p105）和NF-κB2（p52/p100）共5種蛋白，多數(shù)情況下p65與p50組成同源或異源二聚體，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移及侵襲過程［13-15］。IκB家族包含IκBα、IκBβ、IκBε、NF-κB前體蛋白及核IκB蛋白，是NF-κB通路的抑制蛋白家族，非激活狀態(tài)下，NF-κB p65可與IκB蛋白結(jié)合停留在胞漿不發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，NF-κB p65蛋白由胞漿向核轉(zhuǎn)移是NF-κB信號通路激活的關(guān)鍵點(diǎn)［16-17］。任麗平等［18］研究報(bào)道，槐定堿可通過上調(diào)IκB-α蛋白，下調(diào)NF-κB p65蛋白及其下游炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，抑制胰腺癌capan-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，SIM可促進(jìn)IκB-α蛋白表達(dá)，抑制NF-κB p65蛋白表達(dá)，提示SIM可能通過上調(diào)IκB-α抑制NF-κB p65通路激活從而抑制食管癌Eca109細(xì)胞增殖。Shalkami等［19］研究報(bào)道，順鉑可顯著增加大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6水平，培哚普利治療后可上調(diào)大鼠腎組織caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2、TNF-α、IL-6表達(dá)，可減輕順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎毒性作用。Kim等［20］研究報(bào)道，SIM聯(lián)合貝加莫汀通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，下調(diào)介導(dǎo)細(xì)胞增殖（cyclin D1）、細(xì)胞存活（cIAP-1、Bcl-2、Bcl-xL和survivin）、侵襲（MMP-9）和血管生成（VEGF）相關(guān)蛋白的表達(dá)，引起TNF誘導(dǎo)的慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞S期阻滯，促進(jìn)其凋亡，且與對照組比較，SIM聯(lián)合貝加莫汀可抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化、IκB-α降解和p65向細(xì)胞核移位。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，SIM可降低食管癌Eca109細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平及胞核p65蛋白表達(dá)，p65核移位可刺激炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-2和IL-1β等產(chǎn)生及分泌，炎性因子又可激活NF-κB表達(dá)，形成正反饋環(huán)路，提示SIM可能通過降低TNF-α和IL-6水平負(fù)反饋調(diào)節(jié)NF-κB p65通路，抑制p65核移位，減輕炎癥反應(yīng)，抑制食管癌Eca109細(xì)胞增殖。

綜上所述，辛伐他汀可抑制食管癌Eca109細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與上調(diào) IκB-α，下調(diào) cyclin D1、c-Myc、抑制p65核移位及NF-κB p65通路下游炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)有關(guān)。