于非非 吳金賢 鐘智明 梁綺雯 劉 永

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 湛江 524088)

企鵝珍珠貝[Pteria penguin(R?ding;1798)]具有培育大型優(yōu)質(zhì)海水珍珠的多種優(yōu)勢(shì), 被看作我國(guó)“振興南珠”最有潛力的品種。珍珠的色澤是評(píng)判珍珠品質(zhì)的重要指標(biāo), 目前企鵝珍珠貝所產(chǎn)珍珠多以墨綠色、藍(lán)黑色等深色系列為主, 這主要取決于黑色素的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[1]。篩選珍珠貝有效的黑色素增強(qiáng)劑, 調(diào)控增加黑色素的含量, 有望生產(chǎn)出純黑的大顆粒珍珠, 大幅度提高珍珠品質(zhì)。

丙戊酸(Valproic acid, VPA)因具有抑制組蛋白脫乙酰基酶的活性, 作為一種廣譜的抗癇藥物[2]和潛在的抗癌藥物[3,4]而被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。近些年, 越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸具有促進(jìn)人類(lèi)黑色素細(xì)胞生成的作用[5,6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn), 低濃度丙戊酸可以加深企鵝珍珠貝1—7月齡稚貝殼色, 而不降低其存活率[7], 暗示著丙戊酸可以影響企鵝珍珠貝黑色素合成, 這對(duì)于珍珠貝色澤調(diào)控提供了新的啟示。

哺乳動(dòng)物黑色素的合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程, 至少有3條通路參與了這個(gè)過(guò)程[8,9]。貝類(lèi)黑色素相關(guān)研究較少, 尚無(wú)完整信號(hào)通路報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn), 環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,Creb2)、小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Melanogenesis associated transcription factor,Mitf)、酪氨酸酶(Tyrosinase,Tyr)、Cdk2 (Cyclindependent kinase 2) 和Bcl2 (B-cell lymphoma2) 等基因可能參與了企鵝珍珠貝的黑色素合成, 一個(gè)Creb2-Mitf-Tyr-melanin軸可能存在于企鵝珍珠貝黑色素合成信號(hào)通路中[10,11]。那么, 丙戊酸是否可調(diào)控企鵝珍珠貝成貝黑色素的合成, 又是通過(guò)怎樣的途徑發(fā)揮作用, 成為值得探討的問(wèn)題。

基于以上目的, 本研究首先通過(guò)存活率檢測(cè),分析生產(chǎn)上安全有效的丙戊酸作用濃度和時(shí)間; 利用HPLC-MS/MS檢測(cè)和酪氨酸酶活性分析, 驗(yàn)證丙戊酸對(duì)企鵝珍珠貝黑色素合成的影響; 通過(guò)realtime RT-PCR, 分析丙戊酸對(duì)Mitf和Tyr等一系列黑色素相關(guān)基因表達(dá)的影響, 以闡明丙戊酸調(diào)控企鵝珍珠貝黑色素合成的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用的企鵝珍珠貝取自廣西北海潿洲島,重400—450 g, 殼長(zhǎng)13—15 cm。實(shí)驗(yàn)貝在25—26℃的循環(huán)海水中暫養(yǎng)1周, 期間主要投喂扁藻(Isochrysis zhanjiangensis)和湛江等鞭金藻(Platymonas subcordiformis)。

1.2 丙戊酸處理及存活率分析

將企鵝珍珠貝分成4組, 每組30個(gè)樣品。實(shí)驗(yàn)組分別用終濃度為1、10和100 mmol/L的丙戊酸浸泡處理24h、48h和72h, 接著置于新鮮海水中休養(yǎng);對(duì)照組為不含丙戊酸的海水養(yǎng)殖組。第7天時(shí), 計(jì)算每組實(shí)驗(yàn)貝的存活率, 取其外套膜用于基因表達(dá)分析、酪氨酸酶活性分析和黑色素檢測(cè)。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Gaithersburg MD)提取企鵝珍珠貝的外套膜總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量, 用NanoDrop ND1000分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量。利用Superscript Ⅱpolymerase kit(全式金, 北京, 中國(guó))反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4 熒光定量PCR分析

利用SYBF Green qPCR Kit(Thermo scientific,Waltham, MA, USA)和 7500/7500 Fast Real-time系統(tǒng)(ABI, Carlsbad, CA, USA)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。以企鵝珍珠貝18S rRNA作為內(nèi)參, 每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù), 每組做6個(gè)平行樣品。采用2-??Ct法計(jì)算相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平, 所用引物見(jiàn)表 1。

表1 所用引物序列Tab. 1 Primers used in the study

1.5 酪氨酸酶活性分析

取0.5 g企鵝珍珠貝外套膜組織加入1 mL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 6.8), 徹底勻漿; 10000 r/min離心10min, 以獲得上清液; 將0.5 mL組織上清液、0.5 mL 5 mmol/L L-DOPA和2.4 mL 0.1 mmol/L PBS混合均勻, 于37℃水中孵育30min, 在分光光度計(jì)475 nm處檢測(cè)吸光值。酪氨酸酶活性用475 nm處孵育30min增加或減少的吸光值來(lái)代表, 每組分析6個(gè)平行樣品。

1.6 黑色素的提取與氧化

取0.5 g外套膜組織, 勻漿徹底后加入15 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)和0.3 g(2%m/v)木瓜蛋白酶,55℃下酶解20h, 離心收集沉淀。依次用2 mL石油醚、無(wú)水乙醇和去離子水洗滌, 完全干燥即得黑色素粗品。然后將黑色素粗品溶解于8.6 mL 1 mol/L K2CO3和0.8 mL 3% H2O2混合液中, 100℃水浴20min; 取出冷卻至常溫后加入0.4 mL 10% Na2SO3終止反應(yīng), 用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至1.0。離心后取上清, 用70 mL乙醚萃取2次, 干燥獲得結(jié)晶。用0.5 mL 10%甲醇溶液復(fù)溶, 0.45 μm有機(jī)濾膜中過(guò)濾, 即得黑色素堿性氧化產(chǎn)物。每組提取氧化并分析6個(gè)平行樣品。

1.7 LC-MS/MS分析

利用LC-MS/MS檢測(cè)黑色素堿性氧化產(chǎn)物的含量和成分[12,13]。利用高效液相色譜系統(tǒng)(Waters,Milford, Massachusetts, USA)對(duì)色譜分離, 其色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSST3 (2.1 × 50 mmol/L,1.7 μm)。流動(dòng)相A為0.1% (v/v)甲酸水溶液, 流動(dòng)相B為0.1% (v/v)甲酸甲醇溶液。分析開(kāi)始時(shí)流動(dòng)相A和B的比例分別為90%A和10%B; 3min后, 使用線性梯度將流動(dòng)相B的分?jǐn)?shù)增加至100%; 5min后, 使用線性梯度將流動(dòng)相比率恢復(fù)至初始條件, 每個(gè)循環(huán)7min, 在40℃下以0.3 mL/min的流速進(jìn)行分析。使用Xevo TQ 三重四極桿質(zhì)譜的ESI模式進(jìn)行MS分析。源溫度為150℃, 去溶劑化溫度為550℃, 錐形氣體流量為50 L/h, 去溶劑化氣體流量為1100 L/h,碰撞氣體流量為0.14 mL/min(氬氣)。使用MRM模式檢測(cè), 參數(shù)如表 2。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0(IBM, Armonk, State of New York, USA)進(jìn)行方差分析, 檢測(cè)不同樣本間差異的顯著性。顯著性差異以*表示(P<0.05), 極顯著差異以**表示(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 丙戊酸的生物毒性檢測(cè)

為了檢測(cè)丙戊酸對(duì)企鵝珍珠貝的生物毒性, 同時(shí)摸索生產(chǎn)上可安全使用的作用濃度和作用時(shí)間,我們檢測(cè)了1、10、100 mmol/L VPA作用0、24h、48h和72h對(duì)企鵝珍珠貝存活率的影響。如圖 1所示, 1和10 mmol/L VPA作用0—72h, 對(duì)企鵝珍珠貝的存活率均無(wú)顯著影響(P>0.05)。但100 mmol/L VPA作用24h、48h和72h顯著降低存活率至83.3%(P<0.05), 76.7%(P<0.05)和70.0%(P<0.01), 并顯示出明顯的時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。這說(shuō)明高濃度(100 mmol/L)丙戊酸作用24h以上對(duì)企鵝珍珠貝成貝具有一定的生物毒性, 10 mmol/L作用72h是最大的安全使用濃度和作用時(shí)間。

2.2 丙戊酸增加企鵝珍珠貝黑色素的含量

為了驗(yàn)證丙戊酸是否可影響企鵝珍珠貝的黑色素合成, 利用LC-MS/MS分析1、10和100 mmol/L丙戊酸處理72h后, 企鵝珍珠貝外套膜中黑色素含量的變化。因黑色素的主要成分是不溶于酸堿溶液的DHI(5,6-di hydroxyindole)和DHICA(5,6-di hydroxyindole-2-carboxylic acid), 但其堿性氧化產(chǎn)物PDCA(Pyrrole-2, 3-dicarboxylic acid)和PTCA(Pyrrole-2,3,5-tricarboxylic acid)可溶于酸溶液和堿溶液, 因此PDCA和PTCA被廣泛用于黑色素的定性和定量分析。由圖 2所示, 1 mmol/L VPA對(duì)企鵝珍珠貝的黑色素含量沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。10 mmol/L VPA可顯著提高黑色素的含量(PDCA+PTCA)43.7%(P<0.05), 100 mmol/L VPA可顯著提高黑色素的含量(PDCA+PTCA)47.1%(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明,高濃度的丙戊酸(≥10 mmol/L)作用72h可有效促進(jìn)企鵝珍珠貝的黑色素合成。

表2 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Tab. 2 Details of mass spectrometric detection

圖1 丙戊酸的毒性檢測(cè)Fig. 1 The toxicity test of valproic acid on P. penguin

圖2 丙戊酸對(duì)黑色素含量的影響Fig. 2 The effects of VPA on melanin content of P. penguin

2.3 丙戊酸提高企鵝珍珠貝酪氨酸酶活性

酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶, 酪氨酸酶活性升高是黑色素合成的重要標(biāo)志[12]。比較丙戊酸處理前后外套膜的酪氨酸酶活性, 以進(jìn)一步確定丙戊酸對(duì)企鵝珍珠貝黑色素合成的影響。以475 nm波長(zhǎng)下L-DOPA轉(zhuǎn)化為多巴色素(Dopachrome)的速率代表酪氨酸酶活性。1 mmol/L VPA作用72h, 對(duì)酪氨酸酶活性沒(méi)有顯著影響(P>0.05); 10 mol/L VPA可使酪氨酸酶活性增加59.7%(P<0.05), 100 mol/L VPA則可使酪氨酸酶活性顯著增加136.1%(P<0.01,圖 3)。這說(shuō)明高濃度的丙戊酸(≥10 mol/L)可以顯著增加企鵝珍珠貝酪氨酸酶活性。

2.4 丙戊酸調(diào)控黑色素合成通路基因的表達(dá)

為了闡述丙戊酸發(fā)揮作用的信號(hào)通路, 我們對(duì)丙戊酸處理72h后黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析。如圖 4所示, 1 mol/L VPA對(duì)Creb2、Mitf、Tyr、Bcl2和Cdk2等基因的表達(dá)均無(wú)顯著影響(P>0.05)。10 mol/L VPA可以顯著提高M(jìn)itf的表達(dá)至1.65倍(P<0.05), 100 mol/L 可提高至1.93倍(P<0.05)。相應(yīng)地, 10 mol/L VPA可使Tyr轉(zhuǎn)錄本提高至1.38倍(P<0.05), 100 mol/L 可使Tyr轉(zhuǎn)錄本提高至2.10倍(P<0.01)。10 mol/L VPA增加Bcl2轉(zhuǎn)錄本至1.90倍(P<0.01), 100 mol/L VPA增加Bcl2轉(zhuǎn)錄本至2.73倍(P<0.01)。但是, VPA對(duì)Creb2的表達(dá)沒(méi)有顯著影響(P>0.05), 即使VPA的濃度高達(dá)100 mol/L。另外,10 mol/L VPA可顯著提高Cdk2表達(dá)水平至1.47倍(P<0.05), 但100 mol/L VPA對(duì)Cdk2卻未產(chǎn)生明顯的影響(P>0.05)。

圖3 丙戊酸對(duì)酪氨酸酶活性的影響Fig. 3 The effect of VPA on tyrosinase activity of P. penguin

圖4 丙戊酸對(duì)黑色素合成通路基因表達(dá)的影響Fig. 4 The effect of VPA on expression of PpCreb, PpMitf,PpTyr, PpBcl2 and PpCdk2

3 討論

3.1 丙戊酸可有效促進(jìn)企鵝珍珠貝黑色素合成

黑色素參與了有機(jī)體多種生物學(xué)過(guò)程, 包括著色、皮膚保護(hù)、癌癥和老化等[13], 黑色素增強(qiáng)劑和抑制劑的開(kāi)發(fā)在臨床上具有重要的價(jià)值[14,15], 對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物則具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值[16]。丙戊酸是一種短鏈脂肪酸, 具有抗驚厥和抗癌等多種作用[17], 也被報(bào)道可以促進(jìn)人類(lèi)黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)和黑色素的合成[4,6], 但是否在貝類(lèi)具有相似的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用不同濃度的丙戊酸處理企鵝珍珠貝成貝, 發(fā)現(xiàn)≥10 mol/L丙戊酸處理72h可以顯著增加黑色素含量, 暗示丙戊酸能夠影響企鵝珍珠貝黑色素合成。同時(shí), 丙戊酸還可顯著提高酪氨酸酶活性, 因?yàn)槔野彼崦甘呛谏睾铣傻年P(guān)鍵限速酶, 酪氨酸酶活性被作為黑色素合成的重要標(biāo)志[12], 因此,酪氨酸酶活性的升高進(jìn)一步證實(shí)丙戊酸可以有效地促進(jìn)企鵝珍珠貝的黑色素合成。

3.2 丙戊酸通過(guò)Mitf通路影響企鵝珍珠貝黑色素合成

在哺乳動(dòng)物的黑色素合成通路中,Mitf是核心轉(zhuǎn)錄因子[18], 可與Tyr啟動(dòng)子的M-box(CATGTG)或E-box(CACGTG)結(jié)合, 激活黑色素合成限速酶Tyr的表達(dá), 參與黑色素的合成[19,20]。Mitf還可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活Bcl2基因, 參與調(diào)控黑色素細(xì)胞的存活[21,22]; 通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活Cdk2基因, 參與調(diào)控黑色素細(xì)胞的增殖[8]。在本研究中, 丙戊酸顯著增加了Mitf的表達(dá)水平, 同時(shí)顯著提高了Tyr、Bcl2和Cdk2等基因的表達(dá)水平, 暗示丙戊酸可能通過(guò)Mitf基因影響了細(xì)胞的黑色素合成、細(xì)胞存活和增殖過(guò)程,也進(jìn)一步證實(shí)企鵝珍珠貝中Mitf作為核心轉(zhuǎn)錄因子的可能性。需要說(shuō)明的是, 100 mol/L VPA可使Mitf轉(zhuǎn)錄本顯著提高, 但并未顯著提高Cdk2的表達(dá)。一個(gè)可能的原因是高濃度VPA對(duì)細(xì)胞具有一定毒副作用, 這種毒副作用不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。雖然VPA誘導(dǎo)表達(dá)了大量MITF蛋白, 但MITF更多參與了黑色素的合成和細(xì)胞的存活過(guò)程, 以幫助細(xì)胞提高存活率。

Creb2是一種細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子, 具有典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。在CREB磷酸化后, 可以識(shí)別Mitf啟動(dòng)子的CRE(cAMP response element)序列, 調(diào)控Mitf的表達(dá)[23,24]。值得一提的是, 本研究中VPA可以顯著提高M(jìn)itf以及其下游基因的表達(dá), 但不能影響Creb2的表達(dá)。一種可能的解釋是, VPA可能影響了CREB的磷酸化過(guò)程, 但對(duì)Creb2的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有影響, VPA仍是通過(guò)Creb-Mitf-Tyr-melanin發(fā)揮作用。Lin等[25]利用小鼠P12細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),VPA可以增加磷酸化CREB的水平, 提高CREB活性, 激活CREB依賴(lài)的cAMP信號(hào)通路, 這為我們的推論提供了佐證。VPA不影響Creb2的另一可能原因是, VPA并不依賴(lài)于Creb2發(fā)揮作用,而是通過(guò)其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控Mitf-Tyr-melanin通路, 最終調(diào)控企鵝珍珠貝黑色素的合成。

3.3 丙戊酸安全作用濃度和作用時(shí)間分析

丙戊酸是否存在毒副作用是一個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題。Lin等[25]認(rèn)為丙戊酸可以在臨床上廣泛用于治療神經(jīng)類(lèi)疾病, 沒(méi)有任何副作用。Chodurek等[5]卻報(bào)道, 1 mol/L丙戊酸作用3d即可顯著提高人類(lèi)A-375細(xì)胞的黑色素的含量, 降低細(xì)胞的存活率。本研究發(fā)現(xiàn), 1 mol/L丙戊酸對(duì)企鵝珍珠貝黑色素的含量、酪氨酸酶活性、相關(guān)基因表達(dá)水平以及存活率均無(wú)顯著影響; 10 mol/L丙戊酸處理72h可顯著提高黑色素的含量、酪氨酸酶活性和相關(guān)基因表達(dá)水平, 但對(duì)成貝存活率仍無(wú)顯著影響; 但100 mol/L丙戊酸處理72h在提高黑色素的含量、酪氨酸酶活性和相關(guān)基因表達(dá)的同時(shí), 也顯著降低了成貝存活率。因此, 雖然貝類(lèi)活體比人類(lèi)細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的耐受性, 但高濃度(100 mol/L)的丙戊酸對(duì)貝類(lèi)是具有一定毒性的, 10 mol/L丙戊酸處理72 h對(duì)于企鵝珍珠貝可能是最大作用濃度和最長(zhǎng)作用時(shí)間, 這為在生產(chǎn)上建立珍珠貝的色澤優(yōu)化技術(shù)提供了重要數(shù)據(jù)。