狂犬病病毒抗原的濃縮及純化工藝的研究

張 寧 龔本義 劉冬禹 楊丹丹 殷玉和 吳叢梅

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012）

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種傳染病，一旦發(fā)病100%死亡[1]。狂犬病病毒屬于彈狀病毒科，是一種廣泛傳播的人畜共患疾病[2]。目前，狂犬病除了臨床和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估外，狂犬病的預(yù)防和控制還取決于快速、具體的診斷技術(shù)[3]。本試驗(yàn)根據(jù)需要設(shè)計(jì)了3種不同濃縮純化方法，建立了PEG沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化、Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化、Zn（AC）2沉淀濃縮及Sepharose 4 Fast Flow分離純化制備狂犬病病毒抗原，為狂犬病抗體熒光微球檢測(cè)試紙奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 抗原、血清及細(xì)胞

狂犬病病毒CVS-11株病毒液由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司提供；

狂犬病陽(yáng)性血清由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；

陰性血清由長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司提供；

BHK-21細(xì)胞引自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑

PEG 6000、Zn（AC）2、蔗糖等購(gòu)自北京化工廠以及Ameresco公司；Sepharose 4 Fast Flow 凝膠購(gòu)自GE Healthcare公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗犬IgG 購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

2 方法

2.1 狂犬病滅活病毒液制備

狂犬病病毒CVS-11株病毒液，滅活后制成病毒液[4]，檢驗(yàn)合格后，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 抗原濃縮純化工藝的研究

將病毒液，4℃、3000r/min離心30min，取上清備用。

2.2.1 PEG沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化 上清液加入NaCl使終濃度為0.5mol/L，加等量10% PEG 6000，4℃過(guò)夜，8000r/min離心30min，沉淀加入PBS后為濃縮病毒。取濃縮液以蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化（梯度依次為20%、30%、40%、55%），可見(jiàn)40～55%間有白色條帶，用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)確定此條帶為純化狂犬病病毒。

2.2.2 Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化 上清液加入Zn（AC）2，靜置30min，10000r/min 4℃離心30min，沉淀以飽和EDTA 懸浮，4℃溶解至溶液透明，3000r/min 4℃離心30min，上清即為病毒濃縮液。取其以蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化，可見(jiàn)40～55%間有白色條帶，用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)確定此條帶為純化狂犬病病毒。

2.2.3 Zn（AC）2沉淀濃縮及Sepharose 4 Fast Flow純化上清液加入Zn（AC）2，靜置30min，10000r/min 4℃離心30min，沉淀以飽和EDTA懸浮，4℃溶解至溶液透明，3000r/min 4℃離心30min，上清即為病毒濃縮液。用 Sepharose 4 Fast Flow對(duì)濃縮病毒液進(jìn)行純化[4]。

2.3 純化病毒檢驗(yàn)

（1）蛋白濃度檢驗(yàn) BCA法測(cè)定蛋白含量。

（2）蛋白純度檢驗(yàn) 進(jìn)行SDS-PAGE，分析蛋白純度。

（3）Western-blotting。

（4）活性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 濃縮純化抗原濃度和純度檢驗(yàn)

純化抗原總量和純度PEG沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化法均低于后兩種方法，Zn（AC）2沉淀濃縮后蔗糖密度梯度離心純化抗原與Sepharose 4 Fast Flow純化后收獲蛋白總量和純度見(jiàn)表1，純化SDS-PAGE和Western-blotting 見(jiàn)圖1、圖2。

表1 3種方法純化抗原檢測(cè)結(jié)果

圖1 Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化抗原SDS-PAGE圖譜

圖2 Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化抗原Westernblotting圖譜

3.2 濃縮純化抗原活性檢測(cè)

PEG沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化抗原制備的檢測(cè)試紙條熒光強(qiáng)度弱于后兩種方法，Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化抗原與Zn（AC）2沉淀濃縮及Sepharose 4 Fast Flow純化抗原制備的檢測(cè)試紙條熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異，見(jiàn)表2。

表2 不同病毒抗原制備試紙條熒光強(qiáng)度

4 結(jié)論

通過(guò)上述3種純化方法制備狂犬病病毒抗原蛋白進(jìn)行病毒含量、純度及與活性檢驗(yàn)，考慮成本及工藝，選擇Zn（AC）2沉淀法濃縮及蔗糖密度梯度離心純化法制備狂犬病病毒抗原。此方法制備的狂犬病病毒純化抗原用熒光微球標(biāo)記后可有效結(jié)合兔抗狂犬病病毒IgG。