■李軍德 梅浩男 宋吉英*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109）

自1883年德國化學(xué)家Bemthsen成功發(fā)現(xiàn)并合成吩噻嗪以來，吩噻嗪類化合物得到了廣泛的應(yīng)用。鹽酸氯丙嗪（Chlorpromazine hydrochloride，CPZ）和奮乃靜（Perphenazine，PPZ）是吩噻嗪類的代表性藥物，因具有鎮(zhèn)定、止吐、降低動物代謝等作用，二者在畜禽生產(chǎn)中有一定的應(yīng)用，通常會在飼料中進行添加，而其蓄積性殘留會對人體健康造成危害[1]。因此，對飼料中添加性藥物篩查和分析檢測方法的探索越來越重要。熒光分析法因靈敏度高、操作簡便，在鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的分析檢測中得到了廣泛應(yīng)用[2-14]。鹽酸氯丙嗪和奮乃靜因其母核中有吩噻嗪結(jié)構(gòu)，本身有內(nèi)源熒光，但內(nèi)源熒光強度較弱，特別是樣品中含量低的話，直接進行分析檢測很難被檢測到，因此可通過一些反應(yīng)增強其熒光強度。本研究在傳統(tǒng)的熒光分析方法基礎(chǔ)上加以改進，在鹽酸氯丙嗪和奮乃靜加入色素，形成的絡(luò)合物熒光強度明顯增強，可成功用于飼料樣品中吩噻嗪類藥物的痕量分析檢測，為飼料添加劑的安全合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：F-2500型熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；GL-12B 離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BP-10酸度計（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；AR124CN電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

試劑：鹽酸氯丙嗪標(biāo)準品（批號：100460-200501，中國藥品生物制品檢定所）；奮乃靜標(biāo)準品（批號：100133-201403，中國食品藥品檢定所）；醌茜素（上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）；大黃素（瑞迪生物科技有限公司）；色譜乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；試驗用水均為超純水；市售飼料樣品。

分別取鹽酸氯丙嗪、奮乃靜、醌茜素、大黃素標(biāo)準品0.020 0、0.020 0、0.002 5、0.002 5 g，準確稱量，用乙醇溶解并定容至50 ml 棕色容量瓶中，得到濃度分別為0.40、0.40、0.05、0.05 mg/ml 各標(biāo)準溶液，作為儲備液備用。

1.2 光譜分析參數(shù)和分析測定

λEX=258 nm，λEM=452 nm，掃描范圍EX-220～380 nm，EM-400～550 nm，狹縫寬度EX-5 nm，EM-5 nm，掃描速度300 nm/min，延遲時間0 s，電壓400 V。

在鹽酸氯丙嗪和奮乃靜標(biāo)準溶液加入一定量的醌茜素溶液，使醌茜素和吩噻嗪藥物的質(zhì)量比為20∶100，調(diào)整溶液的pH 值為5～6 的弱酸性環(huán)境，20 ℃條件下反應(yīng)0.5 h進行熒光掃描。

1.3 飼料樣品的預(yù)處理

市售飼料樣品粉碎，稱取樣品5.0 g左右，置于碘量瓶中，加入25 ml乙醇，磁力攪拌30 min，離心，上清液旋蒸至干，用5 ml 乙醇溶解燒瓶底部的殘留物，溶液用一次性0.45 μm 有機濾膜過濾，加入醌茜素，調(diào)整溶液的pH 值為5～6 的弱酸性環(huán)境，20 ℃下絡(luò)合反應(yīng)0.5 h，待測。

1.4 鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的激發(fā)波長與發(fā)射波長的確定

取一定濃度的鹽酸氯丙嗪和奮乃靜標(biāo)準溶液，在不同的激發(fā)波長下對其熒光光譜掃描，以確定其熒光發(fā)射波長λEM；根據(jù)得到的λEM，對鹽酸氯丙嗪和奮乃靜進行激發(fā)光譜掃描，以確定其熒光發(fā)射波長λEX。

1.5 鹽酸氯丙嗪-醌茜素絡(luò)合反應(yīng)影響因素的試驗

1.5.1 確定絡(luò)合反應(yīng)質(zhì)量比的試驗

取6 支棕色容量瓶，加入一定量的鹽酸氯丙嗪，再加入不同量的醌茜素溶液，使醌茜素和鹽酸氯丙嗪的質(zhì)量比分別為1∶100、5∶100、10∶100、20∶100、40∶100、80∶100，調(diào)整溶液pH 值為5～6，20 ℃下反應(yīng)0.5 h后進行熒光光譜掃描并比較其熒光強度。

1.5.2 確定絡(luò)合反應(yīng)pH值的試驗

取5支棕色容量瓶，加入醌茜素和鹽酸氯丙嗪溶液，使其質(zhì)量比為20∶100，調(diào)整溶液的pH 值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10，20 ℃下反應(yīng)0.5 h 后進行熒光光譜掃描并比較其熒光強度。

1.5.3 確定絡(luò)合反應(yīng)時間

取5支棕色容量瓶，加入醌茜素和鹽酸氯丙嗪溶液，使其質(zhì)量比為20∶100，調(diào)整溶液的pH值為5～6，20 ℃下反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h后進行熒光光譜掃描并比較其熒光強度。

1.5.4 確定絡(luò)合反應(yīng)溫度

取5支棕色容量瓶，加入醌茜素和鹽酸氯丙嗪溶液，使其質(zhì)量比為20∶100，調(diào)整溶液的pH值為5～6，分別在20、30、40、50、60 ℃條件下反應(yīng)0.5 h進行熒光光譜掃描，

1.5.5 正交試驗

單因素之間對試驗結(jié)果是相互影響的，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計四因素三水平正交試驗，正交試驗的因素和水平見表1。按照表1的因素和水平安排正交試驗內(nèi)容，根據(jù)熒光強度確定因素主次關(guān)系。

1.6 奮乃靜-醌茜素絡(luò)合反應(yīng)影響因素

在奮乃靜中加入醌茜素，奮乃靜-醌茜素絡(luò)合物熒光強度的影響因素，采用與1.5 類同的試驗方法進行考察。

表1 正交試驗的因素和水平

1.7 大黃素和醌茜素對吩噻嗪類藥物熒光增敏效果對比

試驗各取3 份相同濃度的鹽酸氯丙嗪和奮乃靜標(biāo)準溶液，一份做參比，另外兩份分別加入大黃素和醌茜素并在最佳試驗條件反應(yīng)后進行熒光光譜掃描。

1.8 標(biāo)準工作曲線的制備

取不同體積的鹽酸氯丙嗪和奮乃靜儲備液，依次配制成系列濃度分別為0.5、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/ml的標(biāo)準溶液，加入醌茜素，調(diào)整溶液的pH值為5～6，20 ℃下絡(luò)合反應(yīng)0.5 h，測其熒光強度，以溶液的濃度（c）為橫坐標(biāo)，熒光強度（F）為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準工作曲線。

1.9 加標(biāo)回收試驗

在市售飼料樣品中分別加入不同量的鹽酸氯丙嗪和奮乃靜，用乙醇提取，按照1.3的方法進行處理和測定，根據(jù)測定結(jié)果計算加標(biāo)回收率。所有試驗平行3次，結(jié)果取平均值。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗中數(shù)據(jù)處理采用Origin 8.0統(tǒng)計分析軟件進行處理和計算，結(jié)果以“平均值”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的激發(fā)波長與發(fā)射波長

按照1.4 的步驟進行光譜掃描，不同激發(fā)波長下鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的熒光譜圖見圖1。鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的發(fā)射波長λEM分別為453 nm和454 nm，二者基本相同；在不同激發(fā)光波長照射下，目標(biāo)物的熒光強度也各不相同；在得到的發(fā)射波長下對鹽酸氯丙嗪和奮乃靜進行激發(fā)光譜掃描，激發(fā)光譜見圖2，其激發(fā)波長λEX均為258 nm。

圖1 不同激發(fā)波長下鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的發(fā)射光譜

圖2 鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的激發(fā)光譜

2.2 影響鹽酸氯丙嗪-醌茜素絡(luò)合反應(yīng)的因素

2.2.1 醌茜素和鹽酸氯丙嗪的質(zhì)量比

按照1.5.1 的試驗方法進行光譜掃描，不同質(zhì)量比條件下鹽酸氯丙嗪-醌茜素絡(luò)合物的對比熒光譜見圖3。由圖3 可知，醌茜素和鹽酸氯丙嗪的質(zhì)量比不同，絡(luò)合物的熒光強度也各不相同，但其熒光發(fā)射峰波長基本相同。隨著醌茜素和鹽酸氯丙嗪質(zhì)量比的增大，絡(luò)合物熒光強度逐漸增強，當(dāng)質(zhì)量比為20∶100時，絡(luò)合物熒光強度最大；質(zhì)量比超過20∶100時，熒光強度開始下降。

圖3 醌茜素和鹽酸氯丙嗪的質(zhì)量比對絡(luò)合物熒光強度的影響

2.2.2 絡(luò)合反應(yīng)的pH值

按照1.5.2的試驗方法進行光譜掃描，不同pH值條件下鹽酸氯丙嗪-醌茜素絡(luò)合物的對比熒光譜見圖4。由圖4 可知，酸性條件下，溶液酸性越弱，絡(luò)合物的熒光強度越大，pH值為5～6時，熒光強度較大；當(dāng)pH值大于6即是堿性環(huán)境下，熒光強度逐漸減弱。

圖4 pH值對鹽酸氯丙嗪-醌茜素絡(luò)合物熒光強度的影響

2.2.3 絡(luò)合反應(yīng)時間

按照1.5.3 的試驗方法進行光譜掃描，不同反應(yīng)時間下鹽酸氯丙嗪-醌茜素絡(luò)合物的對比熒光譜見圖5。由圖5 可知，隨著反應(yīng)時間的增加，絡(luò)合物的熒光強度減弱，因為時間越長，絡(luò)合物的穩(wěn)定性會降低，熒光強度也會隨之減弱，反應(yīng)時間控制在0.5 h 內(nèi)。

圖5 反應(yīng)時間對鹽酸氯丙嗪-醌茜素絡(luò)合物熒光強度的影響

2.2.4 絡(luò)合反應(yīng)溫度

按照1.5.4 的試驗方法進行光譜掃描，不同反應(yīng)溫度條件下鹽酸氯丙嗪-醌茜素絡(luò)合物的對比熒光譜見圖6。由圖6可知，溫度升高，絡(luò)合物的熒光強度減弱，因為絡(luò)合物對熱穩(wěn)定性差，溫度升高會使其分解從而使熒光強度減弱，反應(yīng)溫度控制在20 ℃。

圖6 溫度對鹽酸氯丙嗪-醌茜素絡(luò)合物熒光強度的影響

2.2.5 正交試驗數(shù)據(jù)

按照1.5.5的正交試驗方法對每個試驗組進行光譜掃描，正交試驗結(jié)果的考察指標(biāo)為絡(luò)合物的熒光強度，正交試驗可確定因素影響的主次關(guān)系和最優(yōu)試驗方案。由表2可知，不同因素和水平組合所得的試驗結(jié)果各不相同，根據(jù)得到的因素主次關(guān)系和最優(yōu)試驗方案，正交試驗結(jié)果和單因素試驗結(jié)論一致。

表2 正交試驗和結(jié)果分析

2.3 鹽酸氯丙嗪和奮乃靜與醌茜素形成絡(luò)合物的最佳試驗條件（見表3）

表3 吩噻嗪藥物與醌茜素形成絡(luò)合物的最佳試驗條件

表3 列出了鹽酸氯丙嗪和奮乃靜與醌茜素形成絡(luò)合物的最佳試驗條件，包括溶液的pH、醌茜素和吩噻嗪藥物的質(zhì)量比、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度。

2.4 大黃素和醌茜素對吩噻嗪類藥物熒光增敏效果分析

按照1.8 的試驗方法進行光譜掃描，熒光增敏效果的對比圖譜見圖7。大黃素和醌茜素對鹽酸氯丙嗪和奮乃靜均有熒光增敏作用，但醌茜素的熒光增敏效果要高于大黃素，故試驗選擇醌茜素作為增強鹽酸氯丙嗪和奮乃靜熒光強度的絡(luò)合劑，加入醌茜素后，鹽酸氯丙嗪和奮乃靜形成的絡(luò)合物，其熒光發(fā)射波長都發(fā)生了輕微的藍移，發(fā)射波長λEM均為452 nm。

2.5 方法的性能數(shù)據(jù)(見圖8)

圖7 鹽酸氯丙嗪和奮乃靜與不同色素絡(luò)合的熒光光譜

圖8 鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的標(biāo)準工作曲線

按照1.7 的方法以溶液的濃度(c)為橫坐標(biāo)，熒光強度F為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準工作曲線，得鹽酸氯丙嗪的線性回歸方程為F=2.469 5c+4.577 6，R2=0.990 1，線性范圍0.5～20.0 μg/ml；奮乃靜的線性回歸方程為F=2.126 6c+4.307 5，R2=0.991 6，線性范圍0.5～20.0 μg/ml。加標(biāo)回收試驗中鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的平均加標(biāo)回收率分別為101.3%和97.8%，相對標(biāo)準偏差RSD 分別為4.3%和5.4%。

3 討論

3.1 鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的激發(fā)波長

鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的激發(fā)光譜圖中均有258 nm和303（306）nm 兩個激發(fā)峰，在303（306）nm 的激發(fā)波長下，鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的熒光強度都很弱，故試驗選擇258 nm作為鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的最大激發(fā)波長。鹽酸氯丙嗪和奮乃靜的激發(fā)波長和發(fā)射波長相同，是因為二者具有相同的吩噻嗪母核結(jié)構(gòu)，只是吩噻嗪環(huán)上的N原子所連的基團存在差異，但這兩種不同基團對吩噻嗪環(huán)的熒光強度沒有顯著的影響。

3.2 pH值對絡(luò)合物熒光強度的影響

溶液的酸堿性會對吩噻嗪類藥物的熒光強度造成較大影響，這是由吩噻嗪類藥物的分子結(jié)構(gòu)決定的，溶液pH值會直接影響其電子云分布，使吩噻嗪類藥物的熒光光譜發(fā)生變化。當(dāng)pH 值＜5 時，與醌茜素絡(luò)合的鹽酸氯丙嗪是強陽離子，熒光強度較弱；當(dāng)pH值為5～6 時，鹽酸氯丙嗪是兩性離子，絡(luò)合物的熒光強度也隨之增大；當(dāng)體系pH值繼續(xù)升高，鹽酸氯丙嗪變?yōu)殛庪x子，導(dǎo)致絡(luò)合物的熒光強度逐漸減弱。

3.3 反應(yīng)機理

吩噻嗪類藥物本身有內(nèi)源熒光，但其內(nèi)源熒光強度相對較弱。部分色素對物質(zhì)的熒光強度有著較大的影響，大黃素和醌茜素均具有高共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，是良好的π電子受體[14]；作為吩噻嗪類的代表性藥物，鹽酸氯丙嗪和奮乃靜分子結(jié)構(gòu)中的吩噻嗪母核決定了兩種分子都具有良好的給電子性，因此吩噻嗪類藥物可與大黃素和醌茜素形成絡(luò)合物使其熒光強度增強，吩噻嗪母核中氮原子的質(zhì)子化作用可使形成的絡(luò)合物平面剛性結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。從分子結(jié)構(gòu)來看，醌茜素分子的平面結(jié)構(gòu)剛性比大黃素更穩(wěn)定，因而與吩噻嗪類藥物分子形成的絡(luò)合物也更加穩(wěn)定，對絡(luò)合物的熒光增敏效果也更明顯。

4 結(jié)論

醌茜素對鹽酸氯丙嗪和奮乃靜等吩噻嗪類藥物有明顯的熒光增敏作用，可與其形成絡(luò)合物，絡(luò)合物的熒光強度增強。

絡(luò)合反應(yīng)的最佳條件為醌茜素和吩噻嗪藥物的質(zhì)量比20∶100，pH 值為5～6 的弱酸性環(huán)境，20 ℃下反應(yīng)0.5 h。

本試驗建立了一種在吩噻嗪類藥物中加入醌茜素增強其熒光強度以對吩噻嗪類藥物進行檢測的熒光分析法，該方法簡單、快速，可用于飼料樣品中吩噻嗪類藥物的含量測定。