■孫建政 王曉娜 孫國君 沈思軍

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832000）

微生物在青貯飼料發(fā)酵過程中有著重要作用，其動(dòng)態(tài)繁殖規(guī)律會(huì)直接影響青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。參與青貯過程的微生物種類很多，包括有利于青貯飼料發(fā)酵的有益微生物以及引起青貯腐敗變質(zhì)的有害微生物[1]。乳酸菌是青貯發(fā)酵過程中最主要的有益微生物，它的大量繁殖能使青貯飼料穩(wěn)定發(fā)酵，改善飼料的發(fā)酵品質(zhì)。酵母菌、霉菌和梭狀芽孢桿菌等是青貯發(fā)酵過程中的主要有害微生物。酵母菌被認(rèn)為是青貯初期變質(zhì)最重要的微生物，它能使pH升高，降低飼料的營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)，甚至產(chǎn)生毒素[2]。梭狀芽孢桿菌屬于青貯飼料的腐敗細(xì)菌，它們主要分解青貯飼料中的蛋白質(zhì)和氨基酸，使青貯飼料腐爛變質(zhì)，產(chǎn)生臭味[3]。霉菌通過呼吸作用將纖維素和其他細(xì)胞壁組分分解產(chǎn)生有毒物質(zhì)，降低青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前通常在青貯飼料中添加甲酸、乙酸和丙酸等化學(xué)發(fā)酵抑制劑，抑制青貯發(fā)酵過程中有害微生物的活動(dòng)，提高青貯飼料質(zhì)量[4]。該法與常規(guī)青貯法相比，雖然飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少損失50%～67%，但制作成本和技術(shù)要求較高，并且液體有機(jī)酸具有腐蝕性，在生產(chǎn)中存在安全隱患，與實(shí)際生產(chǎn)差距較大。因此，如何有效緩解飼料青貯時(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的降低幅度，探索出生產(chǎn)高品質(zhì)青貯飼料的新方法，一直是當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注和研究的熱點(diǎn)問題。

植物精油具有顯著的抑菌活性和廣譜抗菌作用，與化學(xué)抑菌劑相比副作用小、殘留毒性低，已成為當(dāng)前新型天然抑菌劑的研究熱點(diǎn)[5]。楊昭等[6]研究發(fā)現(xiàn)，牛羊飼料中添加牛至精油，能夠抑制多種有害菌（霉菌、大腸桿菌和好氧細(xì)菌）的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)飼料的保存期限。余行等[7]研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油、肉桂精油和生姜精油對(duì)霉菌均有一定的抑制作用，延長(zhǎng)顆粒飼料的保存期。松針精油是松針中的一種主要活性成分，具有良好的抑菌作用[8-10]。松針精油作為天然防腐劑，目前研究主要集中在食品防腐方面，對(duì)青貯飼料中微生物抑制效果的研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究松針精油對(duì)青貯飼料中主要微生物的抑制效果，為松針精油在青貯飼料抑菌方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

松針精油：以樟子松松針為原料，采用水蒸氣蒸餾法提取精油。

菌種：嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilusCICC6075）、酵 母 菌（Saccharomyces cerevisiaeCICC1810）、梭 狀 芽 孢 桿 菌（Bacillus fusiformisCICC10067）、串 珠 鐮 刀 菌（Fusarium moniliformeCICC2490）均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備

以嗜酸乳桿菌、梭狀芽孢桿菌、酵母菌、串珠鐮刀菌為供試菌種。將梭狀芽孢桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；嗜酸乳桿菌采用MRS肉湯，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h；串珠鐮刀菌采用察氏培養(yǎng)基，酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。取部分菌液用生理鹽水稀釋成105～106CFU/ml 菌株懸浮液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法[11]。采用二倍稀釋法將松針精油用DMSO溶劑稀釋成系列濃度(0.064～65.8 mg/ml)，在96孔板上每孔各加入100 μl營(yíng)養(yǎng)肉湯和20 μl菌液濃度為106CFU/ml的菌液。另外，對(duì)照組每孔加入DMSO溶液100 μl，試驗(yàn)組每孔加入100 μl松針精油。在搖床中培養(yǎng)16 h，取20 μl菌液涂布于平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，結(jié)果以無菌生長(zhǎng)的最低精油濃度為MIC值。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定

采用濾紙片法測(cè)定。用無菌棉簽蘸取105CFU/ml的菌懸液，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面均勻涂抹3 次，室溫干燥5 min。將濾紙片(直徑6.0 mm)平放于無菌平板內(nèi)，精油組滴加不同濃度精油20 μl，并以DMSO作為對(duì)照，室溫自然晾干，用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面，每個(gè)處理重復(fù)3 次。培養(yǎng)24 h，以十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 松針精油對(duì)供試菌種生長(zhǎng)曲線的影響

將供試菌種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取出部分菌液，分為對(duì)照組和松針精油組，對(duì)照組將菌液直接用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基稀釋到菌體個(gè)數(shù)為105～106CFU/ml；精油組將菌液加到含精油濃度為最低抑菌濃度的液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、48 h 取樣測(cè)活菌數(shù)，制作出對(duì)照組生長(zhǎng)曲線和精油組生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 松針精油對(duì)供試菌種的最低抑菌濃度

以青貯飼料中的有益微生物（嗜酸乳桿菌）和有害微生物（酵母菌、梭狀芽孢桿菌以及串珠鐮刀菌）為供試菌種，測(cè)定松針精油對(duì)四種菌種的最低抑菌濃度，其試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，對(duì)照組平板上均有大量菌落生長(zhǎng)，說明DMSO對(duì)四種微生物沒有抑制作用；在一定濃度范圍內(nèi)，精油組除嗜酸乳桿菌外，其他三種微生物在平板上都會(huì)被抑制。說明松針精油對(duì)酵母菌、梭狀芽孢桿菌以及串珠鐮刀菌都有一定的抑制作用。松針精油對(duì)串珠鐮刀菌的抑制作用最強(qiáng)，其MIC值為4.112 5 mg/ml；其次是對(duì)酵母菌的MIC值為8.225 0 mg/ml；對(duì)梭狀芽孢桿菌的抑制作用僅次于酵母菌，其MIC值為16.450 0 mg/ml；而對(duì)嗜酸乳桿菌幾乎起不到抑制作用。由此可見，松針精油對(duì)青貯飼料中四種菌種的抑制效果存在著一定的差異，強(qiáng)弱順序依次為：串珠鐮刀菌＞酵母菌＞梭狀芽孢桿菌＞嗜酸乳桿菌（無抑制效果）。

表1 松針精油對(duì)供試菌種的最低抑菌濃度

2.2 松針精油對(duì)供試菌種的抑菌活性

從表2中可以看出，濾紙片中加入DMSO后，串珠鐮刀菌、酵母菌、梭狀芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌平板上均沒有出現(xiàn)抑菌圈，說明DMSO 對(duì)它們沒有抑制作用。當(dāng)濾紙片中加入不同濃度的松針精油后，在一定濃度范圍內(nèi)，串珠鐮刀菌、酵母菌和梭狀芽孢桿菌平板上均出現(xiàn)不同大小的抑菌圈，并且隨著精油濃度的增加，抑菌圈直徑逐漸增大。其中松針精油對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌效果最為顯著，最大濃度抑菌圈直徑達(dá)到15.52 mm，屬于中度敏感；酵母菌對(duì)松針精油的敏感度也屬于中度敏感，最大濃度抑菌圈直徑為12.46 mm；梭狀芽孢桿菌對(duì)松針精油的敏感度為低度敏感，其最大濃度抑菌圈直徑僅為9.46 mm；而嗜酸乳桿菌對(duì)松針精油完全不敏感，沒有出現(xiàn)抑菌圈。說明松針精油對(duì)串珠鐮刀菌、酵母菌和梭狀芽孢桿菌都表現(xiàn)出抑制作用，對(duì)嗜酸乳桿菌沒有抑制作用。綜上所述，松針精油對(duì)青貯飼料中主要微生物的抑制效果存在較大差異，對(duì)青貯有益微生物沒有抑制效果，而對(duì)青貯主要有害微生物有著較強(qiáng)的抑制作用，其抑菌活性大小依次為：串珠鐮刀菌＞酵母菌＞梭狀芽孢桿菌＞嗜酸乳桿菌（無抑制作用），這一結(jié)果與最低抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果相吻合。

表2 松針精油對(duì)供試菌種的抑菌活性

2.3 松針精油對(duì)供試菌種生長(zhǎng)曲線的影響

圖1 松針精油對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1可知，對(duì)照組嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)曲線完全符合“S”型生長(zhǎng)曲線，有明顯的遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。在0～4 h 處于遲緩期，4 h～16 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16～24 h進(jìn)入穩(wěn)定期，從24 h之后進(jìn)入衰亡期，最大活菌數(shù)為1.08×109CFU/ml。加入松針精油之后，嗜酸乳桿菌的遲緩期仍為0～4 h，而對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)至20 h，并且最大活菌數(shù)較對(duì)照組增加27.36%?？梢姡舍樉蛯?duì)嗜酸乳桿菌并沒有起到抑制效果，反而起到了一定的促進(jìn)作用，延長(zhǎng)了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，導(dǎo)致菌體數(shù)量達(dá)到了一個(gè)新的峰值，并且延緩了衰亡期的到來。

圖2 松針精油對(duì)酵母菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖2可知，對(duì)照組酵母菌的生長(zhǎng)曲線符合微生物正常的生長(zhǎng)規(guī)律，有明顯的遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期以及衰亡期。在0 h～8 h處于遲緩期，8 h以后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h 以后進(jìn)入穩(wěn)定期，32 h 以后進(jìn)入衰亡期，最大活菌數(shù)為6.7×108CFU/ml。加入松針精油之后，酵母菌的遲緩期被延長(zhǎng)，延長(zhǎng)至16 h，16 h以后進(jìn)入短暫的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體數(shù)量沒有達(dá)到正常的峰值，其最大活菌數(shù)較對(duì)照組降低56.72%，并經(jīng)過短暫的穩(wěn)定期，迅速進(jìn)入衰亡期。因此，可以看出，松針精油對(duì)酵母菌有著較強(qiáng)的抑制作用，破壞了酵母菌的生長(zhǎng)規(guī)律，遲緩期時(shí)間變長(zhǎng)，較大幅度地降低了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體的生長(zhǎng)峰值。

圖3 松針精油對(duì)串珠鐮刀菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖3可知，對(duì)照組串珠鐮刀菌在0～16 h處于生長(zhǎng)遲緩期，16～36 h 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36～48 h 處于穩(wěn)定期，最大活菌數(shù)為2.5×109CFU/ml。在加入松針精油后，串珠鐮刀菌生長(zhǎng)遲緩期延長(zhǎng)到24 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短到32 h，并且菌體數(shù)量的峰值較對(duì)照組菌體降低39.68%。由以上分析可看出，松針精油對(duì)串珠鐮刀菌的生長(zhǎng)有著極為明顯的抑制效果，能較長(zhǎng)時(shí)間的抑制串珠鐮刀菌的生長(zhǎng)，縮短了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌種的生長(zhǎng)時(shí)間，大幅度降低最大活菌數(shù)。

圖4 松針精油對(duì)梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖4可知，對(duì)照組梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線符合“S”型生長(zhǎng)曲線，在0 h～8 h 處于遲緩期，8 h～24 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h～32 h 處于穩(wěn)定期，32 h～48 h處于衰亡期，最大活菌數(shù)為8.8×108CFU/ml。加入松針精油后，遲緩期延長(zhǎng)到12 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短，最大活菌數(shù)較對(duì)照組菌體降低61.14%，并且經(jīng)過短暫的穩(wěn)定期，迅速進(jìn)入衰亡期?？梢?，松針精油對(duì)梭狀芽孢桿菌有一定的抑制作用。

3 討論

MIC 值是評(píng)價(jià)植物精油抑菌效果的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)抑菌圈直徑的大小也能反映出植物精油抑菌能力的高低[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，松針精油對(duì)嗜酸乳桿菌沒有抑制作用，這與曾維才等[15]、王改琴等[16]和Park等[17]研究結(jié)果基本一致。由此可見，乳酸桿菌的確對(duì)植物精油的敏感性較弱，甚至某些植物精油對(duì)乳酸桿菌沒有抑制作用。本試驗(yàn)中松針精油之所以對(duì)乳酸菌沒有抑制作用，其原因一方面可能與松針精油的化學(xué)成分和濃度有關(guān)，另一方面可能與乳酸菌中的活性抑菌成分乳酸菌素有關(guān)，它能對(duì)乳酸菌起到一定的保護(hù)作用，并且具有一定的穩(wěn)定性。然而，松針精油對(duì)梭狀芽孢桿菌、酵母菌和串珠鐮刀菌有著較強(qiáng)的抑制作用，其最低抑菌濃度分別為16.450 0、8.225 0、4.112 5 mg/ml，最大濃度的抑菌圈直徑分別為9.46、12.46 mm和15.52 mm，這與Zeng等[18]、Mo等[19]和董小英等[20]研究結(jié)果存在一定差異。其原因可能與植物精油的品種、化學(xué)成分以及試驗(yàn)方法有關(guān)。

生長(zhǎng)曲線法可通過微生物的生長(zhǎng)曲線反映群體的生長(zhǎng)規(guī)律，揭示藥物的抑菌效力，并從中判斷藥物對(duì)微生物產(chǎn)生的效果等各種信息[21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組菌體的生長(zhǎng)曲線符合“S”型生長(zhǎng)曲線，遵循微生物正常的生長(zhǎng)規(guī)律。而添加松針精油之后，酵母菌、梭狀芽孢桿菌以及串珠鐮刀菌的生長(zhǎng)受到抑制，遲緩期延長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短，并且最大活菌數(shù)較對(duì)照組有較大幅度的下降。這與孟霞霞[22]的試驗(yàn)結(jié)果一致。其主要原因可能是在遲緩期，微生物對(duì)抑菌劑高度敏感，松針精油的抑菌效果最強(qiáng)，從而使這三種微生物的遲緩期延長(zhǎng)；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于精油的高度揮發(fā)性，導(dǎo)致精油抑制效果降低，因此這三種菌體可以進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；然而松針精油可能破壞了某些菌體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致一些菌體發(fā)生了不可逆的改變，從而使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短，活菌數(shù)達(dá)不到正常的峰值[23]。然而松針精油對(duì)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)起到一定促進(jìn)作用，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期被延長(zhǎng)以及最大活菌數(shù)有所升高，這與Kivnac 等[24]、Chaves 等[25]和 賈 彥 等[26]研 究 結(jié) 果 一致。其原因可能是松針精油中的有效成分為菌體的生長(zhǎng)提供了促進(jìn)因子，也可能是乳酸菌分泌的某些酶將松針精油中的某些物質(zhì)分解成為自身可以利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)[27]。

4 結(jié)論

松針精油作為一種天然植物提取物，具有良好的抑菌活性。體外抑菌試驗(yàn)表明，松針精油對(duì)青貯飼料中主要微生物的抑制效果存在較大的差異，對(duì)主要有害微生物有著較強(qiáng)的抑制作用，其抑制作用強(qiáng)弱順序依次為：串珠鐮刀菌＞酵母菌＞梭狀芽孢桿菌，但對(duì)青貯有益菌（嗜酸乳桿菌）的生長(zhǎng)可以起到一定的促進(jìn)作用。