■翁俊杰 艾 蓉 傅玲琳 王彥波* 劉長軍

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310018；2.浙江象山縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江象山315700）

目前我國水產(chǎn)養(yǎng)殖正處于穩(wěn)定發(fā)展的階段，據(jù)報道，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量約占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%[1]，且規(guī)模仍在不斷擴(kuò)大。然而，傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式帶來的水產(chǎn)動物安全隱患和養(yǎng)殖環(huán)境惡化引起了廣泛的關(guān)注。此外，抗生素及其他化學(xué)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中不合理使用和濫用引起的殘留和耐藥性現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了消費者的食用安全，因此如何借助于新的技術(shù)手段，研究和開發(fā)新一代飼料和飼料添加劑成為研究的熱點。近年來隨著包括基因工程、酶工程、微生物工程等在內(nèi)的生物技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，水產(chǎn)動物生物飼料逐漸成為飼料行業(yè)和生物飼料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢之一，目前關(guān)聯(lián)的水產(chǎn)動物飼用益生菌、抗菌肽、酶制劑、飼料酵母、微藻、單細(xì)胞蛋白等均已逐漸用于水產(chǎn)養(yǎng)殖且取得了顯著的效果。隨著全球飼料行業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，蛋白資源的緊缺和環(huán)境保護(hù)的加強(qiáng)已成為制約相關(guān)行業(yè)發(fā)展的重要因素，依托現(xiàn)代生物技術(shù)并加快其在水產(chǎn)動物生物飼料研究中的應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。

1 基因工程

1.1 基因工程與飼用益生菌

研究表明，飼用益生菌可以通過改變與養(yǎng)殖動物相關(guān)的微生物群落，起到維護(hù)動物胃腸道微生物群的生態(tài)平衡、保護(hù)其正常生理功能的作用，從而達(dá)到改善飼料利用率、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等目的，而且還能減少由抗菌藥物引起的動物畸變和抗生素耐藥性等問題。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較多的益生菌種類包括乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌、芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌等。近年來，隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，逐漸應(yīng)用到飼用益生菌中，通過構(gòu)建工程菌的方法可以使之表達(dá)一些有用的外源基因，擴(kuò)大其生物學(xué)功能，從而達(dá)到一種制劑發(fā)揮多種功能的目的，而且還能增強(qiáng)益生菌的穩(wěn)定性。Santos 等[2]通過基因融合手段在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)了煙曲霉菌的植酸酶基因，構(gòu)建后的菌株不僅明顯減弱了植酸在斑馬魚飲食中的抗?fàn)I養(yǎng)作用，還促進(jìn)了斑馬魚的生長。Lin 等[3]同樣發(fā)現(xiàn)通過重組技術(shù)構(gòu)建的益生菌可以改善斑馬魚的營養(yǎng)代謝和肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，且對嗜水氣單胞菌和無乳鏈球菌的抵抗力也得到顯著增強(qiáng)。研究表明，飼料中添加能表達(dá)木聚糖酶基因的重組解淀粉芽孢桿菌R8，飼喂尼羅羅非魚60 d 后發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)與碳水化合物代謝相關(guān)的酶基因以及肝臟中的胰島素樣生長因子-1（Insulin like Growth Factor, IGF-1）基因的表達(dá)水平顯著升高，提高了飼料利用率和對嗜水氣單胞菌的抵抗力[4]。基因工程應(yīng)用于飼用益生菌的安全性也引起了關(guān)注，Zhao 等[5]利用基因克隆技術(shù)從凝結(jié)芽孢桿菌中克隆了新型α-半乳糖苷酶，經(jīng)過蛋白質(zhì)活性和抗性分析，在揭示其顯著的蛋白酶抗性和高水解活性基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究證實了飼用安全性。

1.2 基因工程與飼用抗菌肽

由于抗菌肽在體內(nèi)的表達(dá)水平較低，且提取和純化既困難又昂貴，所以目前商業(yè)上的飼用抗菌肽主要是通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)。近年來隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，泥鰍、河豚、鱸魚、青蟹等水產(chǎn)動物抗菌肽基因被克隆，為飼用抗菌肽的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加飼用抗菌肽可以顯著改善水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫力和對疾病的抵抗力，最終促進(jìn)動物生長發(fā)育，He等[6]利用基因工程成功在小球藻中表達(dá)了重組抗菌肽Scy-hepc，體外和體內(nèi)的結(jié)果表明飼喂表達(dá)了抗菌肽的小球藻可顯著增強(qiáng)鯉魚對嗜水氣單胞菌的抵抗力。進(jìn)一步研究揭示不同的飼用抗菌肽抗菌機(jī)制有所不同。迄今研究證明飼用抗菌肽主要通過兩種途徑起作用，一種是抗菌肽與病原微生物細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合使膜的通透性發(fā)生改變，從而改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)容物外流導(dǎo)致細(xì)胞死亡；另一種是抗菌肽直接穿過細(xì)胞膜在細(xì)胞中發(fā)揮作用，抑制細(xì)胞的生物學(xué)活動，例如抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性、阻斷DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等。由此可見，抗菌肽與細(xì)胞膜的相互作用對于抗菌肽的功效至關(guān)重要，綜析國內(nèi)外的研究報道，目前主要存在三種肽-膜互作模型（圖1）。桶板模型（Barrel-stave）通過抗菌肽先在膜表面聚集，再以多聚體的形式插入膜雙分子層中，形成一個跨膜離子通道使細(xì)胞質(zhì)外流導(dǎo)致細(xì)胞死亡；環(huán)孔模型（Toroidal）則是通過抗菌肽插入膜中，借助于抗菌肽疏水端可以使膜疏水中心形成裂口，引起膜向內(nèi)彎曲形成一個直徑為1～2 nm 的環(huán)孔；第三種地毯模型（Carpet-like）是一種膜滲透模型，肽不是插入膜中而是在膜表面積聚，形成一個“地毯”覆蓋在膜表面，以“去垢劑”的作用方式破壞細(xì)胞膜而引起細(xì)胞死亡[7]。此外，研究人員也提出了一些其他肽-膜互作模型，如聚集體模型、分子電穿孔和“筏沉沒”模型等，這些對理解抗菌肽的抗菌機(jī)制也是重要的[7]。隨著對水產(chǎn)動物各種抗菌肽結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，通過基因工程構(gòu)建新型的飼用抗菌肽成為未來研究的趨勢，如從河豚的皮膚黏液中提取純化并克隆了新型抗菌肽TpHAMP2，分析表明[8]該重組肽與天然肽具有相同的抗菌活性，這為飼用抗菌肽的商業(yè)化提供了可能。

圖1 抗菌肽作用機(jī)制模型

2 酶工程

2.1 酶工程與飼用效果

飼用酶制劑作為酶工程在飼料行業(yè)的應(yīng)用取得了顯著的效果，涉及飼用植酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶等，近五年酶制劑在水產(chǎn)動物飼料中的研究參見表1。在水產(chǎn)飼料中添加適量的酶制劑可促進(jìn)養(yǎng)殖動物對營養(yǎng)的吸收以改善生長性能。Li 等[9]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加175 mg/kg 蛋白酶可明顯提高飼料干物質(zhì)和蛋白質(zhì)的表觀消化率，且改善了生長性能，此發(fā)現(xiàn)在羅非魚、虹鱒魚和長鰭鯉中均有類似報道。有些植物性飼料原料中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，因此需要對酶進(jìn)行復(fù)配以彌補(bǔ)單一酶改善抗?fàn)I養(yǎng)因子的不足。楊航等[10]用由植酸酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶組成的復(fù)合酶制劑，有效降解了飼料中的植酸、果膠質(zhì)、β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高了草魚對蛋白質(zhì)、磷和干物質(zhì)的利用率。此外，酶制劑在飼料配伍加工過程中的作用時間以及與飼料中其他添加劑的相互作用也引起了關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料制粒和熟化過程中蛋白酶就已經(jīng)發(fā)揮了水解蛋白質(zhì)的作用，該蛋白酶經(jīng)過制粒和熟化過程后活性依然可保留79.3%和67.5%[9]。Zhu等[11]發(fā)現(xiàn)飼料中的檸檬酸可為植酸酶提供適宜的酸性環(huán)境來提高黃鯰魚對磷的利用率。Yao等[12]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加蛋白酶、糖酶和有機(jī)酸鹽可顯著提高太平洋白蝦的生長性能和飼料利用率，且三種添加劑的組合使用比單獨添加具有更顯著的效果。這為科學(xué)合理地設(shè)計包含飼用酶制劑在內(nèi)的生物飼料配方和配套生產(chǎn)工藝提供了理論依據(jù)。

表1 酶制劑在水產(chǎn)動物飼料中的應(yīng)用研究

2.2 酶工程與飼用機(jī)制

基于酶工程技術(shù)的酶制劑在水產(chǎn)動物生物飼料中取得了顯著的應(yīng)用效果，這與酶制劑的生理活性具有顯著的關(guān)聯(lián)。酶制劑的飼用機(jī)制主要包括以下幾個方面：一是降解植物性飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善水產(chǎn)動物對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用。研究發(fā)現(xiàn)添加植酸酶和蛋白酶可消除魚飼料中植酸、蛋白酶抑制劑和植物凝集素的抗?fàn)I養(yǎng)作用，顯著提高尼羅羅非魚對蛋白質(zhì)、磷、礦物質(zhì)和脂質(zhì)的利用率[20]。Castillo等[21]的研究也證實了這一點。二是改善腸道結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)腸道菌群。Adeoye等[22]發(fā)現(xiàn)用復(fù)合酶制劑（植酸酶、蛋白酶和木聚糖酶）飼喂羅非魚可增加腸道微絨毛密度，且飼用前后腸道中變形桿菌和放線菌的菌落特征發(fā)生改變。在草魚的研究中也得到了類似的研究結(jié)果[10]。三是調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水產(chǎn)動物的免疫能力。據(jù)報道，菠蘿蛋白酶可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫應(yīng)答、一氧化氮介導(dǎo)干擾素γ（Interferon-γ，IFN-γ）和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）[23]，而在木瓜蛋白酶上存在的酶促和非酶促位點都可以激活T 淋巴細(xì)胞和先天免疫反應(yīng)[24]。Choi等[19]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加混合蛋白酶喂養(yǎng)草魚后，其體內(nèi)相關(guān)免疫基因表達(dá)顯著增加，免疫力得到顯著改善。

3 微生物工程

3.1 微生物工程與飼用單細(xì)胞蛋白

單細(xì)胞蛋白（single cell protein, SCP）又稱為微生物蛋白。隨著蛋白資源緊張在現(xiàn)代飼料工業(yè)領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注，飼用酵母、細(xì)菌等SCP 均已逐漸應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中且取得顯著效果。其中細(xì)菌SCP 中蛋白含量可高達(dá)80%且易于培養(yǎng)，因此被認(rèn)為是最合適的SCP 生產(chǎn)來源。細(xì)菌主要是以碳?xì)浠衔锘蚣状甲鳛榈孜镞M(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)SCP，因此原料來源非常廣泛，一般的食品加工廢棄物和副產(chǎn)物等均能作為底物來綜合利用，這很大程度上減少了飼料的生產(chǎn)成本。目前SCP生產(chǎn)以固態(tài)發(fā)酵和液體深層發(fā)酵為主，其原料和菌種的多樣性使得在發(fā)酵生產(chǎn)過程中需要多種生物反應(yīng)模式以適合發(fā)酵菌種的增長（表2）。目前用于SCP 生產(chǎn)的細(xì)菌主要包括雙歧桿菌、乳酸菌、光合細(xì)菌、芽孢桿菌等，而一些新型的潛在菌種也在逐步研究中?，F(xiàn)已在魚類和蝦類上成功測試了幾種基于甲烷營養(yǎng)菌的SCP產(chǎn)品[25]。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氨棒桿菌SCP可以替代蝦飼料中10%～20%的魚粉[26]。Tlusty等[27]研究發(fā)現(xiàn)扭脫甲基桿菌SCP 可替代鮭魚飼料中55%的魚粉，在鱒魚飼料中可以替代魚粉10%[28]，而在蝦飼料中能夠完全替代魚粉[27]。此外借助于微生物工程技術(shù)的進(jìn)步，菌種發(fā)酵方式逐步由單一菌種趨向于復(fù)合菌株的協(xié)同發(fā)酵，通過不同菌種間的協(xié)同互補(bǔ)可生產(chǎn)產(chǎn)量更高、營養(yǎng)成分更齊全的SCP。孫立瑞等[29]發(fā)現(xiàn)在甲烷氧化菌培養(yǎng)中加入光合菌能夠明顯促進(jìn)甲烷氧化菌生長，且縮短了發(fā)酵周期，顯著提高了SCP 產(chǎn)量。Chumpol 等[30]在南美白對蝦飼料中添加了1%的兩種紫色非硫細(xì)菌SCP 混合物，蝦的生長性能、免疫力和存活率均得到顯著提高，且顯著優(yōu)于單一SCP。細(xì)菌和微藻的SCP 混合物在斑節(jié)對蝦上的研究結(jié)果同樣表明，SCP可安全替代蝦飼料中的魚粉和魚油[31]，且當(dāng)飼料中添加10%SCP 混合蛋白時就能夠加快生長速度[32]。

表2 不同反應(yīng)模式和微生物種類的比較優(yōu)勢[25]

3.2 微生物工程與飼用微藻

同樣，借助于微生物工程的飼用微藻也已成功用于水產(chǎn)動物生物飼料中，涉及小球藻、螺旋藻、節(jié)旋藻等藻類。研究表明，飼用微藻通過富含的生物活性分子而發(fā)揮其生物學(xué)作用。如飼用微藻中富含的不飽和脂肪酸可有效改善養(yǎng)殖動物體內(nèi)的脂肪酸譜[33]；飼用小球藻中的β-葡聚糖對魚類具有明顯的抗有害菌活性和免疫刺激活性；部分飼用微藻中的類胡蘿卜素可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基侵害，防止脂質(zhì)過氧化和維持重要免疫細(xì)胞、組織的結(jié)構(gòu)完整性，并促進(jìn)生長發(fā)育和提高存活率[33]；飼用微藻中蝦青素的抗氧化、抗高血脂作用可顯著改善魚蝦的健康狀況[34]，在以克氏原螯蝦[35]和金鯧魚[36]為研究對象的實驗中均得到了驗證。

此外，結(jié)合基因工程和微生物工程各自的優(yōu)勢，已逐步應(yīng)用于萊茵衣藻等飼用微藻開發(fā)中[33]，旨在增強(qiáng)飼用微藻的生物學(xué)作用，改善水產(chǎn)動物的免疫力、抗病性。已有研究證明，通過生物技術(shù)改良后可生產(chǎn)牛乳鐵蛋白抗菌肽的飼用微藻，可以顯著增加養(yǎng)殖魚體內(nèi)多不飽和脂肪酸和抗體含量，使魚體對細(xì)菌性腎臟疾病的免疫力得到增強(qiáng)[37]。近五年國內(nèi)外對飼用微藻種類及其在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用研究參見表3。

表3 飼用微藻種類及其在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用

4 展望

基因工程、酶工程、微生物工程等生物技術(shù)的應(yīng)用，為水產(chǎn)動物生物飼料的開發(fā)提供了新的思路。目前飼用益生菌、抗菌肽、酶制劑、微藻等都已應(yīng)用于實際水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，但是由于相關(guān)作用機(jī)理還尚未完全研究清楚，尤其是缺乏在分子和細(xì)胞層面的深入研究，這很大程度上限制了在可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的靶向針對性應(yīng)用。剖析國內(nèi)外的相關(guān)研究，學(xué)科交叉下生物飼料與水產(chǎn)動物互作機(jī)制的深入探究、微生境下各種益生因子關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、迅速發(fā)展的生物技術(shù)背景下可利用資源的拓展等已經(jīng)逐漸成為本領(lǐng)域未來發(fā)展的趨勢，可為水產(chǎn)動物生物飼料的研發(fā)奠定堅實的基礎(chǔ)，為水產(chǎn)品安全生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境保護(hù)提供必要的保障。