非洲豬瘟病毒MGF505-5R蛋白表達與純化

張素玲，吳 芃，岳亞男，白晨雨，郝麗影，李向東，逄文強，田克恭

(國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471003)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一種高致死性傳染病。ASFV具有雙層囊膜結構，基因組大小約180～190 kb[1]，編碼160多種蛋白質，其中50多種為病毒結構蛋白[2-3]。

ASFV基因組包含幾個不同的多基因家族，其中MGF360和MGF505位于基因組高度可變的左端區(qū)域，由其編碼的蛋白質對ASFV的復制及感染均具有重要的影響[4-7]。ASFV編碼的多基因家族能夠抑制感染的巨噬細胞產生Ⅰ型IFN應答，MGF360和MGF530/505等多個基因缺失后，可導致Ⅰ型IFN在感染巨噬細胞中的誘導水平增加，且缺失后的毒株對Ⅰ型IFN敏感，表明這些基因具有抑制IFN應答和抗病毒狀態(tài)的功能[8-9]。敲除ASFV強毒株MGF360和MGF505/530中的多個基因后，病毒在巨噬細胞中的復制能力未受影響，但對家豬的致病力發(fā)生降低；該毒株免疫后能夠針對親本毒株提供較好的攻毒保護，其保護水平和免疫劑量、親本毒株類型和缺失的基因有關[10-12]。上述研究均表明，以多基因家族為靶點的基因缺失疫苗研制是ASFV免疫防控的重要方向之一。因此，體外表達具有生物學活性的MGF蛋白和制備相應的單克隆抗體或多克隆抗體成為免疫學診斷方法建立的前提。

大腸桿菌是用于外源蛋白表達的常用宿主菌株，但是表達的外源蛋白易形成包涵體，不具有生物活性。利用能夠增強重組蛋白可溶性表達的融合標簽SUMO[13-14]、TrxA[15]、GST[16]、MBP[17]和NusA[18]可以提高外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達水平。鑒于此，通過標簽篩選、優(yōu)化表達和純化條件，以獲得高純度可溶性ASFV MGF505-5R蛋白，并制備特異性的多克隆抗體，旨在為ASFV基因缺失疫苗的免疫學鑒別診斷方法的建立奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 質粒和菌株

質粒pET28a購自Novagen公司；菌株DH5α、E.coliBL21(DE3)均購自天根生化科技(北京)有限公司；質粒pET28a-SUMO、pET28a-TrxA、pET28a-GST、pET28a-MBP、pET28a-NusA均為國家獸用藥品工程技術研究中心構建。

1.2 主要試劑

DL2000 Marker、限制性內切酶和T4 DNA連接酶均購自Thermo Fisher公司；2×EasyTaqPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；DNA膠回收試劑盒購自OMEGA公司；質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白質預染Marker購自Thermo Fisher公司；Ni2+親和層析填料、MBP親和層析柱均購自美國GE Healthcare公司；羊抗鼠IgG-HRP二抗購自Abbkine公司；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 基因的擴增及重組表達載體的構建 經過密碼子優(yōu)化的MGF505-5R基因由金唯智合成。根據(jù)合成的基因設計1對特異性引物，F(xiàn)：5′-CGCGGATCCATGTTCTCTCTGCAGGAAAT-3′；R：5′-CCGCTCGAGTTATTCGTAACGCATGTCGG-3′，其中下劃線位置為酶切位點。以合成的MGF505-5R基因為模板進行PCR擴增并回收。將回收的MGF505-5R片段和pET28a載體同時用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切后回收，酶切產物經T4 DNA連接酶連接，構建pET28a-MGF505-5R載體。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將菌液均勻涂布于含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落進行PCR鑒定并送金唯智進行測序。以國家獸用藥品工程技術研究中心前期構建的pET28a-SUMO、pET28a-TrxA、pET28a-GST、pET28a-MBP和pET28a-NusA5個質粒為模板，利用表1中的引物分別PCR擴增His-SUMO、His-TrxA、His-GST、His-MBP和His-NusA基因片段并回收。將回收的5個片段分別用NdeⅠ和BamHⅠ進行雙酶切后回收，然后分別與NdeⅠ和BamHⅠ酶切后的pET28a-MGF505-5R載體連接，構建pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R、pET28a-GST-MGF505-5R、pET28a-MBP-MGF505-5R和pET28a-NusA-MGF505-5R表達載體。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落進行PCR鑒定并送金唯智進行測序，將5種測序正確的質粒分別轉化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞。

表1 引物序列

1.3.2 重組蛋白表達與可溶性分析 將5種重組質粒分別轉入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單克隆菌落接種于含有100 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床(220 r/min)過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)過夜的種子按1%的接種量接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床(220 r/min)培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，分別在20 ℃和28 ℃條件下誘導表達10 h。表達結束后，離心收集菌體細胞。按照菌體∶重懸液=1∶10的比例加入PBS，充分重懸菌體細胞。超聲破碎后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE檢測，采用灰度掃描分析法分析重組蛋白表達水平和可溶性。根據(jù)初步表達結果，選擇可溶性表達較好的菌株進行誘導劑含量和誘導時間的優(yōu)化，并進行SDS-PAGE檢測分析。

1.3.3 重組蛋白的純化 取pET28a-MBP-MGF505-5R轉化的E.coliBL21(DE3)按照優(yōu)化的表達條件大量誘導表達。誘導后的菌體加PBS重懸后，800 bar高壓均質破碎。破碎后的樣品4 ℃、12 000 r/min離心1 h，取上清用0.45 μm濾膜過濾后，分別用Ni2+親和層析和MBP親和層析進行純化。Ni2+親和層析用咪唑梯度進行洗雜和洗脫，MBP親和層析選用麥芽糖梯度進行洗雜和洗脫。收集的洗脫蛋白用PBS緩沖液透析后，加入TEV蛋白酶將MBP標簽蛋白切除，然后加入Ni2+填料，4 ℃過夜孵育吸附MBP標簽蛋白，離心取上清用12% SDS-PAGE檢測。

1.3.4 動物免疫 MGF505-5R蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1混合后乳化，以每只小鼠100 μg的劑量對6周齡雌性BALB/c小鼠進行皮下免疫；以弗氏不完全佐劑充分乳化MGF505-5R蛋白，并按相同方式和劑量于21、42、63 d進行免疫。最后一次免疫結束后7 d采血，分離血清，采用間接ELISA法檢測免疫血清的抗體效價。

1.3.5 重組蛋白的Western blot分析 純化后的MGF505-5R蛋白電泳后，采用半干法將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，含5%脫脂牛奶粉的封閉液25 ℃封閉2 h，然后加入1∶500稀釋的鼠抗MGF505-5R蛋白血清，4 ℃孵育過夜后棄去，PBST反復洗滌3次。再加入1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP二抗，室溫孵育1 h后棄去，PBST反復洗滌3次。用DAB顯色試劑盒顯色后，觀察結果。

2 結果與分析

2.1 MGF505-5R重組載體的構建與鑒定

以合成的MGF505-5R基因為模板進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1，從圖1可以看出，擴增的MGF505-5R基因片段大小約為1 500 bp，與預期結果一致。MGF505-5R基因片段與pET28a載體連接的質粒測序結果正確，表明pET28a-MGF505-5R載體構建成功。分別以國家獸用藥品工程技術研究中心前期構建的5種質粒為模板，利用表1中的引物分別擴增5種融合標簽蛋白的基因片段，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示。從圖2可以看出，His-SUMO基因、His-TrxA基因、His-GST基因、His-MBP基因和His-NusA基因片段大小分別約為350、300、700、1 000 bp和1 500 bp，均與預期基因片段大小相符。將5種重組質粒分別測序，測序結果與模板堿基序列一致，表明重組表達載體pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R、pET28a-GST-MGF505-5R、pET28a-MBP-MGF505-5R和pET28a-NusA-MGF505-5R均構建成功。

M：DL2000 Marker；1：MGF505-5R基因

M：DL2000；1：His-SUMO基因；2：His-TrxA基因；3：His-GST基因；4：His-MBP基因；5：His-NusA基因

2.2 MGF505-5R重組蛋白表達與可溶性分析

分別取5種菌株表達的上清和沉淀20 μL，加入5 μL 5×Loading Buffer，沸水加熱10 min，進行SDS-PAGE檢測分析。從圖3可以看出，28 ℃誘導表達時，5種菌株均大量表達重組蛋白，但是均為包涵體；20 ℃誘導表達時，SUMO-MGF505-5R、GST-MGF505-5R和TrxA-MGF505-5R重組蛋白仍為不溶性的包涵體，NusA-MGF505-5R和MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達水平提高，其中MBP-MGF505-5R蛋白的可溶性表達水平經過灰度掃描分析可知提高約20%。

A：重組蛋白28 ℃誘導表達結果(M：蛋白質Marker；1、3、5、7、9、11分別為28 ℃誘導表達后的全菌裂解上清；2、4、6、8、10、12分別為28 ℃誘導表達后的全菌裂解沉淀)；B：重組蛋白20 ℃誘導表達結果(M：蛋白質Marker；1、3、5、7、9、11分別為20 ℃誘導表達后的全菌裂解上清；2、4、6、8、10、12分別為20 ℃誘導表達后的全菌裂解沉淀)

對MBP-MGF505-5R重組蛋白的表達條件進行了優(yōu)化，即在20 ℃條件下，設置IPTG濃度梯度：0.2、0.5、0.8 mmol/L，分別誘導8 h和12 h取樣檢測分析MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達水平。從圖4可以看出，當IPTG濃度為0.5 mmol/L時，MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達量最高，但是進一步增加誘導劑濃度到0.8 mmol/L時，MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達水平下降，說明最適誘導劑濃度為0.5 mmol/L。在IPTG濃度為0.5 mmol/L的誘導條件下，誘導時間增加，MBP-MGF505-5R重組蛋白的可溶性表達量提高。

A：重組蛋白誘導表達8 h結果(M：蛋白質Marker；1、3、5分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導表達8 h后的全菌裂解上清；2、4、6分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導表達8 h后的全菌裂解沉淀)；B：重組蛋白誘導表達12 h結果(M：蛋白質Marker；1、3、5分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導表達12 h后的全菌裂解上清；2、4、6分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導表達12 h后的全菌裂解沉淀)

2.3 MBP-MGF505-5R重組蛋白的純化

MBP-MGF505-5R重組蛋白N端含有6×His融合標簽，可以利用MBP 親和層析和Ni2+親和層析進行純化。為了獲得純度較高的目的蛋白，分別進行上述2種純化試驗。洗脫的MBP-MGF505-5R重組蛋白12%進行SDS-PAGE檢測，結果(圖5A)顯示，目的蛋白分子質量約為100 ku?；叶葤呙璺治鼋Y果顯示，Ni2+親和層析純化后純度約為80%，MBP親和層析純化后純度大于90%。去除MBP標簽后，經12% SDS-PAGE檢測，結果(圖5B)顯示，MGF505-5R分子質量約為55 ku。

A：MBP-MGF505-5R重組蛋白的純化(M：蛋白質Marker；1：MBP親和層析純化MBP-MGF505-5R重組蛋白；2：Ni2+親和層析純化MBP-MGF505-5R重組蛋白)；B：MGF505-5R蛋白的純化(M：蛋白質Marker；1：MGF505-5R蛋白)

2.4 MGF505-5R蛋白多克隆抗體的制備

用純化后的MGF505-5R蛋白免疫小鼠后，采集并分離小鼠血清進行間接ELISA檢測血清效價，結果顯示，免疫后的小鼠血清效價達到1∶12 800以上，表明MGF505-5R蛋白活性良好，具有免疫原性，能夠刺激機體產生抗體。

2.5 MGF505-5R蛋白的生物活性分析

Western blot結果顯示，PVDF膜上出現(xiàn)了分子質量約為55 ku的特異性條帶，表明MGF505-5R蛋白活性良好，且免疫小鼠后能產生特異性抗體(圖6)。

M：蛋白質Marker；1：MGF505-5R蛋白

3 結論與討論

ASFV基因組可編碼多種蛋白質，用于調控宿主細胞蛋白質表達、干擾宿主天然免疫系統(tǒng)和調控細胞周期等，從而抑制和逃避宿主的免疫應答，其中ASFV編碼的免疫逃避蛋白MGF360和MGF505/530是基因缺失疫苗研制的主要靶標之一。KING等[19]將ASFV弱毒株OURT88/3進行了部分MGF基因的缺失，與親本病毒相比，MGF基因缺失毒株可以誘導產生較高水平的IFN，且可提供針對同源病毒的保護力。因此，多基因家族基因缺失疫苗有望應用于臨床，成為預防非洲豬瘟的商業(yè)化疫苗。吳映彤[20]建立了針對MGF360-12L和MGF360-13L的分子檢測方法，并利用大腸桿菌原核表達載體對MGF360-12L和MGF360-13L蛋白進行了表達，并對表達的MGF360-12L和MGF360-13L包涵體蛋白進行了純化，為多克隆抗體的制備和間接ELISA檢測方法的建立奠定了基礎。包涵體蛋白因其空間結構不正確，可能不具有生物學活性。因此，利用具有生物學活性的多基因家族蛋白制備相應的單克隆抗體或多克隆抗體，對多基因家族基因缺失疫苗的免疫學鑒別診斷具有重要意義。

本研究選用原核表達系統(tǒng)，通過標簽篩選成功獲得了可溶性的ASFV MBP-MGF505-5R重組蛋白，并利用純化后的MGF505-5R蛋白免疫小鼠制備了特異性的多克隆抗體。ASFV強毒或弱毒株缺失MGF360和MGF530/505基因后免疫動物，可以提供針對同源病毒或部分異源病毒的攻毒保護[21-22]。因此，本研究制備的多克隆抗體有望用于ASFV MGF505相關基因缺失疫苗的臨床免疫學鑒別檢驗，為進一步建立鑒別診斷方法奠定了基礎。