蜘蛛香提取物體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用

秦 楓，劉 云，吳 植，吳 雙，郭長明，顧玲玲，吳曉潔，朱善元

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300; 2.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種急性、接觸性、高度傳染性疾病，通常表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙(如晚期流產(chǎn)、死產(chǎn)和木乃伊)以及新生仔豬和斷奶仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病(如間質(zhì)性肺炎)[1-3]，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。當(dāng)前，控制和預(yù)防該病的主要措施是接種疫苗。滅活苗具有安全、貯存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，但其免疫次數(shù)多、成本較高[5]；弱毒苗具有免疫力強(qiáng)、免疫期長的優(yōu)點(diǎn)，但其存在污染環(huán)境、毒力返強(qiáng)等問題[6]。因此，迫切需要開發(fā)安全、有效且廉價(jià)的抗PRRSV的藥物。

中藥對病毒具有多重作用，毒副作用小且很少產(chǎn)生耐藥性，一些中藥還具有解熱、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等優(yōu)勢。PU等[7]的研究結(jié)果表明，貫葉連翹提取物能極顯著(P<0.01)降低PRRSV病毒滴度，KANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，箬竹提取物(SQE)顯著改變了PRRSV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子基因的表達(dá)，表明SQE影響了病毒感染期間炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)為敗醬科纈草屬植物，又名馬蹄香、老虎七、土細(xì)辛等，微苦、辛、溫，歸心、脾、胃經(jīng)，具有理氣止痛、祛風(fēng)除濕、活血消腫的功效[9-10]。蜘蛛香中含主要含有揮發(fā)油類、生物堿類、黃酮類和環(huán)烯醚萜類等多種成分，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗焦慮和抗抑郁等藥理作用。馬麗娟[11]研究發(fā)現(xiàn)，蜘蛛香能夠治療犬病毒性腸炎。但目前關(guān)于蜘蛛香抗PRRSV的研究還未見報(bào)道。為此，探討蜘蛛香水提物及醇提物的體外抗PRRSV的效果，旨在為開發(fā)抗PRRSV藥物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、病毒與中藥材

Marc-145細(xì)胞和PRRSV SH1705毒株均由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。中藥材蜘蛛香購自安國藥源商貿(mào)有限公司，經(jīng)江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院于生蘭教授鑒定為敗醬科植物蜘蛛香的干燥根莖，標(biāo)本存放于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院中獸藥與天然藥物研發(fā)中心。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶等均購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液(100×)、二甲基亞砜(DMSO)等均購自北京索萊寶科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2.2 主要儀器 生物安全柜由MVE公司生產(chǎn)；酶聯(lián)免疫檢測儀由Bioteck公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱由NVAIRE公司生產(chǎn)；ABI-7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、-80 ℃ 超低溫冰箱均由Thermo公司生產(chǎn)；倒置熒光顯微鏡由Olympus公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 中藥提取

1.3.1.1 蜘蛛香水提物的制備 用傳統(tǒng)水煎煮法提取蜘蛛香水提液。稱取蜘蛛香藥材20 g，粉碎至粉末，10倍水浸泡過夜，煎煮2次，30 min/次，合并濾液，濃縮至浸膏狀。

1.3.1.2 蜘蛛香醇提物的制備 稱取蜘蛛香藥材20 g，粉碎至粉末狀，10倍的60%乙醇浸泡過夜后加熱回流提取3次(第1次2 h，第2、3次分別為1.5 h)，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀[12]。

將上述2種提取液-80 ℃預(yù)凍過夜，冷凍干燥機(jī)干燥，稱質(zhì)量，計(jì)算得率。

1.3.2 藥物安全性測定

1.3.2.1 Marc-145細(xì)胞培養(yǎng) 取出凍存在液氮中的細(xì)胞，立即置于37 ℃ 恒溫水浴鍋中，不停搖動(dòng)，使其快速融化。將該細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有預(yù)熱完全的培養(yǎng)基的離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，用預(yù)熱完全的培養(yǎng)基將其重懸后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[13]，細(xì)胞長至單層后進(jìn)行消化，傳代備用。

1.3.2.2 藥物安全性試驗(yàn) 采用MTT法[14]檢測藥物對細(xì)胞的抑制率，測定其在490 nm處的OD值，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

將細(xì)胞瓶中長至單層的細(xì)胞消化后，計(jì)數(shù)，用含10% FBS的DMEM稀釋至約2×105個(gè)/mL，加入96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞長至單層后，棄去培養(yǎng)液，第1～10列依次從低質(zhì)量濃度至高質(zhì)量濃度加入以安全質(zhì)量濃度起始的藥液，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度重復(fù)4孔，每孔100 μL，11～12列加入細(xì)胞培養(yǎng)液作為細(xì)胞對照，置于 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)72 h后，棄去藥液，加入MTT溶液(PBS溶解，2 g/L)，50 μL/孔，培養(yǎng)4 h后，棄去MTT溶液，加入DMSO完全溶解結(jié)晶，測定OD490值。計(jì)算生長抑制率：生長抑制率=(細(xì)胞對照組OD490-藥物組OD490)/細(xì)胞對照組OD490×100%。

1.3.3 PRRSV病毒滴度測定

1.3.3.1 PRRSV的擴(kuò)增 將細(xì)胞瓶中長至單層的細(xì)胞消化后，棄去舊培養(yǎng)液，用 PBS洗2遍。用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋 PRRSV，接種病毒液至細(xì)胞中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%～90%病變時(shí)，終止培養(yǎng)。將病變細(xì)胞在-80 ℃與4 ℃反復(fù)凍融3次后，收集細(xì)胞懸液，5 000 r/min 離心5 min，收集上清液[15]，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝至EP管內(nèi)，標(biāo)注分裝時(shí)間及批次等，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 TCID50法測定病毒滴度 用不含血清的DMEM培養(yǎng)液將病毒液按照10倍比依次稀釋成10-1～10-8，8個(gè)梯度，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100 μL/孔。每個(gè)稀釋度接種8孔，同時(shí)設(shè)立PRRSV對照組和細(xì)胞對照組，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，棄去病毒液，加入細(xì)胞維持液，觀察5～7 d，記錄細(xì)胞病變情況，采用Reed-Muench法計(jì)算TCID50[16]。

1.3.4 蜘蛛香提取物體外抗PRRSV的效果測定 以各提取物的最大安全質(zhì)量濃度為起始質(zhì)量濃度，用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液2倍比稀釋成4個(gè)質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度重復(fù)4孔，PRRSV液稀釋度為100 TCID50,另設(shè)利巴韋林陽性對照，PRRSV對照及細(xì)胞對照，進(jìn)行阻斷作用試驗(yàn)、抑制作用試驗(yàn)和直接滅活試驗(yàn)。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)的情況，待PRRSV對照組細(xì)胞病變程度達(dá)到80%～90%后，用MTT法測各孔OD490值，計(jì)算細(xì)胞保護(hù)率：細(xì)胞保護(hù)率=(加藥組OD490值-PRRSV對照組OD490值)/(細(xì)胞對照組OD490值-PRRSV對照組OD490值)×100%。

1.3.4.1 直接滅活試驗(yàn) Marc-145細(xì)胞在96孔板中長至單層后，棄去舊培養(yǎng)液，同時(shí)加入50 μL藥液和50 μL病毒液(使藥液最高質(zhì)量濃度為最大安全質(zhì)量濃度和病毒液終含量為100 TCID50)，培養(yǎng)4 h后，棄去藥液，加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液。通過公式計(jì)算得到藥物對病毒的抑制率，篩選出對病毒的抑制率高于50%的蜘蛛香提取物作后續(xù)研究。

1.3.4.2 阻斷作用試驗(yàn) Marc-145細(xì)胞在96孔板中長至單層后，棄去舊培養(yǎng)液，加入以最大安全質(zhì)量濃度為起始質(zhì)量濃度的藥液，每孔100 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去藥液，加入100 TCID50PRRSV液，每孔100 μL，培養(yǎng)2 h后，棄去病毒液，加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液。

1.3.4.3 抑制作用試驗(yàn) Marc-145細(xì)胞在96孔板中長至單層后，棄去舊培養(yǎng)液，加入100 TCID50PRRSV液，每孔100 μL，培養(yǎng)2 h后，棄去病毒液，加入以最大安全質(zhì)量濃度為起始質(zhì)量濃度的藥液，每孔100 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去藥液，加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每天用顯微鏡觀察CPE情況并記錄，且根據(jù)藥物對病毒的抑制率評(píng)價(jià)其抗病毒的效果，抑制率越高，說明其抗病毒作用越強(qiáng)。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜘蛛香提取物得率

稱得蜘蛛香水提物和蜘蛛香醇提物干燥后粉末質(zhì)量分別為7.82 g和7.24 g，得率分別為39.1%和36.2%。

2.2 蜘蛛香提取物對細(xì)胞的安全質(zhì)量濃度測定

細(xì)胞病變觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同藥物對Marc-145細(xì)胞都有一定程度的毒性作用，并且藥物質(zhì)量濃度越高毒性作用越強(qiáng)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增加，變圓、粘連、破碎，出現(xiàn)空泡，甚至脫落。當(dāng)抑制率為0時(shí)，則該質(zhì)量濃度下藥物對細(xì)胞沒有毒性作用。根據(jù)公式計(jì)算藥物對細(xì)胞的生長抑制率，從而確定藥物的最大安全質(zhì)量濃度，結(jié)果見表1。蜘蛛香水提取物及醇提取物、利巴韋林的最大安全質(zhì)量濃度分別為1.250、0.625、0.016 g/L。

表1 不同質(zhì)量濃度蜘蛛香提取物和利巴韋林對Marc-145細(xì)胞的抑制率及最大安全質(zhì)量濃度

2.3 PRRSV的TCID50測定結(jié)果

根據(jù)公式計(jì)算得到PRRSV對Marc-145細(xì)胞的TCID50為10-3.6/mL。

2.4 蜘蛛香提取物抗PRRSV的藥效

2.4.1 對PRRSV的阻斷作用 MTT檢測中藥OD490值，當(dāng)OD490值越高時(shí)，說明藥物對細(xì)胞的保護(hù)作用越強(qiáng)，即對PRRSV的抑制作用越強(qiáng)，蜘蛛香2種提取物的直接滅活作用對PRRSV的抑制率見表2。從表2可以看出，蜘蛛香水提物、蜘蛛香醇提物和利巴韋林對PRRSV的最高抑制率分別為44.6%、107.1%和63.3%。蜘蛛香醇提物對PRRSV的抑制率極顯著(P<0.01)高于利巴韋林陽性對照組。

表2 不同質(zhì)量濃度蜘蛛香提取物在阻斷作用下對PRRSV的抑制率

由圖1可以看出，蜘蛛香水提物組細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，大多細(xì)胞出現(xiàn)團(tuán)聚、圓縮現(xiàn)象，蜘蛛香醇提物組細(xì)胞出現(xiàn)輕微病變，部分細(xì)胞圓縮、團(tuán)聚，但基本保持細(xì)胞單層完好。與PRRSV對照組相比，蜘蛛香水提物組細(xì)胞形態(tài)略好，蜘蛛香醇提物組細(xì)胞形態(tài)基本完好。與利巴韋林陽性對照組相比，蜘蛛香水提物組病變現(xiàn)象較為嚴(yán)重。

A.蜘蛛香水提物；B.蜘蛛香醇提物；C.利巴韋林。下同

2.4.2 對PRRSV的抑制作用 從表3可以看出，蜘蛛香水提物、蜘蛛香醇提物和利巴韋林對PRRSV的最高抑制率分別為37.9%、102.6%和68.9%。蜘蛛香醇提物對PRRSV的抑制率均極顯著(P<0.01)高于利巴韋林陽性對照組。

表3 不同質(zhì)量濃度蜘蛛香提取物在抑制作用下對PRRSV的抑制率

由圖2可知，蜘蛛香水提物組細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，大多細(xì)胞出現(xiàn)團(tuán)聚、圓縮現(xiàn)象，蜘蛛香醇提物組細(xì)胞出現(xiàn)輕微病變，部分細(xì)胞圓縮、團(tuán)聚，但基本保持細(xì)胞單層完好，蜘蛛香醇提物抗病毒效果明顯強(qiáng)于蜘蛛香水提取物。與PRRSV對照組相比，蜘蛛香醇提物具有明顯的抗病毒作用。與利巴韋林陽性對照組相比，蜘蛛香水提物組細(xì)胞病變現(xiàn)象較為嚴(yán)重，蜘蛛香醇提物組細(xì)胞形態(tài)基本完好。

圖2 蜘蛛香提取物對PRRSV的抑制作用(40×)

2.4.3 對PRRSV的直接滅活作用 從表4可以看出，蜘蛛香水提物、蜘蛛香醇提物和利巴韋林對PRRSV的最高抑制率分別為83.5%、120.9%和65.5%。蜘蛛香水提物和醇提物對PRRSV的抑制率均極顯著(P<0.01)高于利巴韋林陽性對照組。

表4 不同質(zhì)量濃度蜘蛛香提取物在直接滅活作用下對PRRSV的抑制率

從圖3可知，PRRSV對照組大部分細(xì)胞出現(xiàn)了圓縮、團(tuán)聚、空泡甚至脫落的現(xiàn)象，而細(xì)胞對照組細(xì)胞保持單層完好。蜘蛛香水提物組和醇提物組基本保持細(xì)胞單層完好。而利巴韋林陽性對照組細(xì)胞病變略嚴(yán)重，細(xì)胞發(fā)生明顯團(tuán)聚、圓縮，并伴隨有脫落現(xiàn)象，與利巴韋林陽性對照組相比，其病變現(xiàn)象較嚴(yán)重。

圖3 蜘蛛香提取物對PRRSV的直接滅活作用(40×)

3 結(jié)論與討論

豬繁殖與呼吸綜合征是一種高度傳染性病毒性疾病，該病已經(jīng)給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，還沒有針對治療豬繁殖與呼吸綜合征的有效藥物。中藥因具有安全性高、毒副作用小等優(yōu)勢，可開發(fā)并將其用作治療病毒性疾病的潛在藥物。

本試驗(yàn)首先采用MTT法評(píng)價(jià)了蜘蛛香提取物對Marc-145細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示，蜘蛛香水提物和醇提物的最大安全質(zhì)量濃度分別為1.25 g/L和0.625 g/L。采用MTT法結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察，并以利巴韋林作為陽性對照，研究了蜘蛛香水提物及醇提物體外對PRRSV的抗病毒作用，結(jié)果表明，與利巴韋林陽性對照相比，蜘蛛香水提物和醇提物具有較強(qiáng)的體外抗PRRSV的作用，對PRRSV均具有較強(qiáng)的阻斷、抑制和直接殺滅作用，且蜘蛛香醇提物抗PRRSV的作用較強(qiáng)。蜘蛛香提取物中的主要有效成分多為環(huán)烯醚萜類和黃酮類。姚干等[17]的研究結(jié)果表明，黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物具有明顯的抗病毒效應(yīng)，其作用機(jī)制可能是抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖和對病毒的直接滅活作用。黃酮具有抗多種病毒的作用，對乙肝病毒[18]、柯薩奇病毒[19]、煙草花葉病毒[20]等都有明顯的抗病毒效果。由此推測，蜘蛛香提取物抗病毒作用的成分可能為黃酮類或環(huán)烯醚萜類成分。

本研究證實(shí)了蜘蛛香提取物體外抗PRRSV的作用，為蜘蛛香用于抗PRRSV的防治提供了重要依據(jù)，其抗PRRSV的作用機(jī)制及在體內(nèi)的抗病毒活性有待進(jìn)一步研究。