不同食品基質中雜環(huán)胺的檢測技術研究進展

李海霞，黃俊源，何昀桐，白衛(wèi)東，曾曉房，董浩

（仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225）

雜環(huán)胺（heterocyclic aromatic amines，HAAs）主要產生于高溫及長時間烹調加工處理富含蛋白質食品（如肉制品等）的過程中[1-3]。20世紀70年代科學家首次發(fā)現雜環(huán)胺以來，目前已經在各類食品中分離和鑒定出超過30種（見表1）不同類型的雜環(huán)胺[4]。一般來說，按照化學結構和生成條件的不同，雜環(huán)胺可分為兩大類：氨基咪唑氮雜芳烴類和氨基咔啉類[5-6]。氨基咪唑氮雜芳烴類一般包括喹啉類、喹喔啉類和吡啶類，主要產生于100℃～300℃之間，由游離氨基酸、肌酸和己糖等前體物經復雜的美拉德反應形成，由于這類雜環(huán)胺在家庭的烹飪條件下就會產生，因此備受人們關注；氨基咔啉類主要是蛋白質或氨基酸在超過300℃的高溫條件下熱解產生[7-8]。

表1 30種從食品中分離和鑒定出的雜環(huán)胺Table 1 30 HAAs isolated and identified from various foodstuffs

雜環(huán)胺是一類高度致突變和致癌物質，能引發(fā)包括獼猴和嚙齒動物肝臟、乳腺、結腸、胃、前列腺、食道等多個器官產生腫瘤病變。國際癌癥研究機構已將2-氨基-3-甲基咪唑并 [4，5-f]喹啉歸類為可疑致癌物（2A 級別），而把 2-氨基-3，4-二甲基咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉等 7 種雜環(huán)胺等列為潛在致癌物（2B級別）[9-11]。經常食用含有雜環(huán)胺的食物會對人體健康產生一定的危害，因此，食品中雜環(huán)胺的分析檢測和暴露評估顯得尤為必要。

目前，雜環(huán)胺已經被報道在畜禽肉制品、魚肉制品、焙烤制品、咖啡制品、乳制品、酒精飲料等多種類型食品中檢出，涉及的檢測方法主要包括高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-質譜聯用法、超高效液相色譜法、高效液相色譜串聯質譜法等[12-24]。由于食品中通常含有大量的油脂、蛋白質、色素等不同類型的雜質，因此在雜環(huán)胺的儀器分析前，還需要對樣品進行適當的前處理，常見的前處理手段主要包括溶劑萃取、固相萃取、分散固相萃取和固相微萃取等[25-27]。盡管這些前處理和檢測技術的應用能夠達到檢測食品中雜環(huán)胺的目的，但由于食品中的雜環(huán)胺僅以痕量水平（μg/kg，ppb級別）存在，再加上檢測過程中易受其他無法祛除雜質的干擾，因此，食品基質中雜環(huán)胺的提取凈化和精準檢測仍是本領域的研究難點[22-23]，高效、快速、高選擇性和高靈敏度的分析檢測方法對于雜環(huán)胺的分析和研究至關重要?；诖?，本文以不同的食品基質為切入點，針對肉制品、魚肉制品、咖啡制品、乳制品、焙烤制品、酒精飲料和其他食品，系統(tǒng)綜述2010年～2019年各類食品中雜環(huán)胺的提取凈化和檢測方法，并對典型的分析方法進行比較，旨在為不同食品基質中雜環(huán)胺的分析檢測和暴露評估提供較為系統(tǒng)的借鑒和參考。

1 肉制品中雜環(huán)胺的分析檢測

肉制品屬于高蛋白質食品，非常容易在烹調等熱加工過程中產生雜環(huán)胺的污染，因此，肉制品中雜環(huán)胺的分析檢測是國內外學者的研究熱點，得到了最為廣泛的報道。郭海濤等[28]對樣品中的雜環(huán)胺進行液-液萃取、陽離子交換柱凈化和富集后，建立同時測定羊肉制品中9種雜環(huán)胺的固相萃取-高效液相色譜（solid phase extraction-high performance liquid chromato-graphy,SPE-HPLC）分析方法，方法的檢出限可達1.6 μg/L～41.0 μg/L，回收率為 50.27%～94.77%。Yan 等[14]建立一種簡便、準確的乙腈萃取預處理結合超高效液相色譜串聯質譜法（ultra-high performance liquid chromatogra-phy tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）方法，可用于同時測定烤豬肉等肉制品中的17種雜環(huán)胺，方法的回收率為42.5%～99.0%，定量限可達0.028 μg/kg～0.648 μg/kg。Aeenehvand 等[16]建立微波輔助萃取-分散液-液微萃取-高效液相色譜法測定漢堡肉餅中3種極性雜環(huán)胺的分析方法，該方法的加標回收率可達90%～105%，檢出限能夠達到 0.06 μg/kg～0.21 μg/kg。同樣地，Vichapong等[29]也利用建立的離子對表面活性劑輔助微波輔助萃取-分散液-液微萃取-高效液相色譜方法對烤豬肉樣品中的4種雜環(huán)胺進行檢測。Hsiao等[12]利用快速樣品前處理技術（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe，QuEChERS）實現了肉制品中雜環(huán)胺的高效提取和凈化，結合LC-MS/MS技術建立同時測定肉制品中20種雜環(huán)胺的分析方法，方法的回收率為58.9%～117.4%，定量限和檢出限分別為0.003 μg/kg～0.05 μg/kg和 0.01 μg/kg～0.05 μg/kg。Vichapong 等[19]采用氣體鼓動濁點萃取法集合HPLC技術，構建一種同時測定煙熏香腸中4種雜環(huán)胺的檢測方法，方法的富集因子可達 80 以上，檢出限為 1 μg/kg～3 μg/kg。Khan等[30]建立同時測定熟駱駝肉中5種致癌/致突變雜環(huán)胺的固相萃取-超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜檢測方法，可用于燒、烤、煎、燉等多種熱加工處理下駱駝肉中雜環(huán)胺的含量檢測。此外，國內外文獻還報道了傳統(tǒng)禽肉制品[31]、牛肉干制品[32]、肉丸[18,33]、雞肉[34-35]、肉湯[36]、燒烤[37]等其他類型肉制品[38-42]中雜環(huán)胺的最新分析檢測方法。

2 魚肉制品中雜環(huán)胺的分析檢測

魚肉當中也含有豐富的蛋白質，再加上魚類加工制品中基質復雜、雜環(huán)胺種類較多但含量較低，因此需要更加靈敏的檢測設備和技術。徐琦等[43]建立同時測定魚類加工品中12種雜環(huán)胺類的超高液相-質譜聯用分析方法，樣品經有機溶劑提取，MCX固相萃取小柱凈化，梯度洗脫，電噴霧離子源正離子模式下檢測，內標法定量，結果發(fā)現方法的平均回收率為42.98%～125.00%，相對標準偏差為1.49%～9.88%，方法檢測限可達 0.3 μg/kg～1.0 μg/kg。Oz 等[44]采用 SPE-HPLC方法，研究微波、平底鍋、烤爐、熱板、燒烤等不同烹調方法和脂肪水平（瘦肉和脂肪）對各種魚類（三文魚、鯖魚、沙丁魚、鱈魚、鱒魚和鱸魚）雜環(huán)胺形成的影響，結果發(fā)現，該方法能夠快速、準確的檢測魚肉制品中9種雜環(huán)胺的含量，燒烤是最容易產生雜環(huán)胺和雜環(huán)胺產生量最高的一種熱加工方式。Wang等[45]同樣采用SPEHPLC方法，研究不同的煎炸條件對草魚中雜環(huán)胺生成的影響，結果發(fā)現隨著煎炸次數的增加，雜環(huán)胺的種類不斷增加，煎炸25次后共檢測到7種類型的雜環(huán)胺。張峰等[15]對烤魚中的雜環(huán)胺進行分析，樣品經甲醇-1.0 mol/L NaOH溶液超聲輔助提取后，Lichrolut EN固相萃取柱凈化，然后經超高液相-質譜聯用分離和檢測，內標法定量，結果表明，15種雜環(huán)胺的定量限為1.0 g/kg，回收率多在79.0%～118.8%之間，相對標準偏差多在1.3%～10.0%之間。肖維等[46]采用MCX固相萃取小柱對魚制品中的8種雜環(huán)胺進行了凈化和富集，結合HPLC技術建立同時測定魚制品中8種雜環(huán)胺的方法，結果表明，該方法的線性關系良好，檢出限為0.3 μg/kg～3.8 μg/kg，以空白樣品為基體進行加標回收試驗，所得回收率為51.8%～93.7%，相對標準偏差在0.89%～3.7%之間。這些方法的建立可為雜環(huán)胺在魚肉制品中的消除規(guī)律以及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段。

3 咖啡制品中雜環(huán)胺的分析檢測

咖啡制品，如速溶咖啡和咖啡粉，一般經過高溫蒸餾、噴霧干燥、烘焙等熱加工工序制作而成，因此，咖啡制品中也存在雜環(huán)胺污染的可能。隨著消費者對咖啡需求的不斷增加，咖啡及其制品中雜環(huán)胺的分析檢測尤為必要。Karpaviiūtc.等[17]建立同時測定炒咖啡中氨基二吡啶并[1，2-a:3′，2-d]咪唑鹽酸鹽、2- 氨基 -6-甲基二吡啶并 [1，2-a:3′，2′-d]咪唑、2-氨基-5-苯基吡啶、2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚5種雜環(huán)胺的固相萃取-高效液相色譜儀-熒光檢測器檢測方法，樣品經乙酸乙酯提取后，Bond Elut PRS固相萃取柱凈化，最后經高效液相色譜檢測，結果表明：方法的檢出限和定量限分別為 0.21 μg/kg～0.51 μg/kg 和 0.38 μg/kg～0.93 μg/kg，方法的加標回收率為40%～56%，實際樣品分析發(fā)現，有1個樣品檢測出2-氨基-1，6-二甲基咪唑并[4，5-6]吡啶。Xian等[47]基于QuEChERS分散凈化、Fe3O4納米粒子脫色以及超高效液相色譜-串聯質譜技術，建立一種同時測定咖啡中丙烯酰胺和雜環(huán)胺等15種有害胺類代謝物的分析方法，結果表明，15種待測物在0.2 μg/L～100 μg/L范圍內線性關系良好；方法定量限為1.0 μg/kg ～6.5 μg/kg；8 種待測物的基質效應可以忽略，7種待測物存在基質抑制；3個添加水平的回收試驗，日內平均回收率為81.6%～100%，日內精密度在4.3%～9.0%之間；日間平均回收率為81.0%～101%，日間精密度為5.0%～7.8%；實際樣品檢測發(fā)現在咖啡和速溶咖啡樣品中均檢出1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚和9H-吡啶并[3，4-b]吲哚兩種雜環(huán)胺，其中9H-吡啶并[3，4-b]吲哚含量較高，在 186.3 μg/kg～976.0 μg/kg之間。從上述文獻的檢測結果可以看出，咖啡粉和速溶咖啡中除了普遍含有備受關注的丙烯酰胺外，還普遍含有 1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚等雜環(huán)胺，因此，除了高效、靈敏、準確的檢測方法構建，還應加強其風險水平和暴露水平的關注。

4 酒精飲料中雜環(huán)胺的分析檢測

目前國內外對酒精飲料中雜環(huán)胺的分析檢測研究較少，然而，Herraiz[48]曾經報道過，發(fā)酵酒中主要是1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚和 9H-吡啶并[3，4-b]吲哚雜環(huán)胺的污染，含量為 0～41 μg/L。Richling 等[49]也曾經采用建立的高效液相色譜-電噴霧串聯質譜檢測方法分析市場上葡萄酒中雜環(huán)胺的含量，結果發(fā)現，25個葡萄酒樣品中，有24個檢測出雜環(huán)胺的污染，含量較高的主要包括2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并 [4，5-b]-吡啶、2-氨基二吡啶并[1，2-a:3′，2-d]咪唑鹽酸鹽、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚，含量水平在 8 ng/L ～107 ng/L。由此可見，酒精飲料中雜環(huán)胺的檢測和含量評估也尤為重要。近年來，王敏等[50]建立液相色譜-離子阱-飛行時間串聯質譜法同時測定葡萄酒中14種雜環(huán)胺含量的分析方法，樣品經Phenomenex strata-X-C陽離子交換固相萃取小柱提取凈化，內標法定量，結果發(fā)現該方法的檢出限為 0.33 μg/L～1.77 μg/L，加標回收率能夠達到71.6%～103.3%，精密度和準確度較高，分析時間短，凈化效果好，可滿足葡萄酒中多種雜環(huán)胺殘留同時檢測的要求?？梢钥闯?，關于酒精飲料中雜環(huán)胺的分析檢測方法還不全面，建立的檢測方法主要集中在葡萄酒等，對于白酒、黃酒等中國傳統(tǒng)釀造酒以及世界消費量最大的啤酒中雜環(huán)胺的分析和檢測還鮮有報道，因此，仍需加強酒精飲料中雜環(huán)胺的分析檢測和暴露評估研究。

5 焙烤食品中雜環(huán)胺的分析檢測

焙烤食品是以小麥等谷物粉料為基本原料，通過發(fā)酵、高溫焙烤過程而熟化的一類食品。在高溫焙烤過程中，這類食品中的還原糖和氨基酸或蛋白質發(fā)生美拉德及焦糖化等反應，產生一系列風味物質，但同時也可能產生一些有害副產物，雜環(huán)胺就是其中的一類。歐陽運富等[51]建立一種加速溶劑萃取-液相色譜-離子阱飛行時間質譜方法，并應用于油炸土豆條等烹調食品中3種常見雜環(huán)胺含量的檢測，樣品首先經乙腈提取，氮吹至干，殘留物定容后經C18色譜柱分離，甲酸溶液和乙腈作為流動相梯度洗脫，正離子模式監(jiān)測，結果表明：3種雜環(huán)胺的檢出限在0.3μg/kg～0.9 μg/kg之間，加標回收率可達79.5%～105%，相對標準偏差在2.1%～6.9%之間，油炸土豆條中檢測出2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉的污染（2.6μg/kg）。Wu等[52]建立焙烤食品（面包、月餅、蛋糕和餅干）中14種雜環(huán)胺類化合物（1-甲基-9H-吡啶并 [3，4-b]吲哚、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]吡啶、2-氨基-1，6-二甲基咪唑并[4，5-b]吡啶、3-氨基-1，4-二甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚、2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉、2-氨基-3，7，8-三甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉和 2-氨基-3，4，7，8-四甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉）的分散固相萃取凈化-超高效液相色譜串聯質譜檢測方法，樣品經乙腈-1 mmol/L氫氧化鈉溶液超聲萃取，N-丙基乙二胺凈化，在C18色譜柱上以乙腈和1 mmol/L乙酸銨（含0.04%乙酸）為流動相梯度洗脫，采用電噴霧離子源、正離子多反應監(jiān)測模式檢測，外標法定量，結果表明，14種待測物在相應的濃度范圍內線性良好，相關系數均大于 0.999；方法定量限為 0.3 μg/kg ～4.5 μg/kg；進行3個水平的添加回收試驗，平均回收率為62.8%～96.8%；相對標準偏差為1.2%～7.6%；應用本方法檢測20個焙烤食品樣品，檢出4種雜環(huán)胺類化合物1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]-吡啶。

6 其他食品中雜環(huán)胺的分析檢測

除了肉制品和以上所述食品，其他食品中雜環(huán)胺的檢測方法和暴露量水平研究也有一定的報道。例如，Gonzalo-Lumbreras等[39]建立一種毛細管液相色譜-質譜聯用技術方法，并應用于軟奶酪等食品中4種雜環(huán)胺（2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉,9H-吡啶并[3，4-b]吲哚，1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚）的檢測，結果發(fā)現，4種雜環(huán)胺的檢出限最低可達0.004 μg/L～0.023 μg/L，4種不同濃度的加標回收率均在85%以上，因此，本方法靈敏準確，適用于軟奶酪等食品中雜環(huán)胺的分析檢測。Naccari等[53]也分析了來自于意大利卡拉布里亞的煙熏“普羅沃拉”奶酪中的雜環(huán)胺，結果得出不同煙熏工藝以及不同部位的奶酪均有雜環(huán)胺的污染，而且含量差異顯著。Chang等[23]采用分散固相萃取與HPLC-MS/MS聯用，建立同時測定未精制和精制烹調油脂中20種雜環(huán)胺的方法，并應用于48種油脂樣品的檢測，結果發(fā)現豬油、椰子油、植物油、其他固體油脂等油脂中均檢出不同種類和含量的雜環(huán)胺。Canales等[54]建立一種基于懸浮有機液滴固化，超聲輔助反萃的新型分散液-液微萃取方法，并結合UHPLCMS/MS技術對自來水中的4種雜環(huán)胺進行了測定，該方法在 2.2 μg/L～50 μg/L之間線性關系良好，方法的檢出限為0.7μg/L～2.9 μg/L，加標回收率可達92%～106%，相對標準偏差在4.3%～6.7%之間，方法準確可靠，適用于自來水以及環(huán)境水樣中雜環(huán)胺的分析檢測。Basheer等[55]同樣建立一種檢測海水中雜環(huán)胺的方法，主要采用微固相萃取和HPLC技術，該方法的檢出限更低，可達0.004μg/L～0.026 μg/L，重現性在1.3%～7.5%之間，加標回收率為79.9%～95.2%，實際樣品中檢測出 1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚（0.07 μg/L）和 2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]-吡啶（0.13 μg/L）的污染。除此之外，牛乳、豆餅、醋、番茄醬、醬油、可可豆等食品中也被報道過雜環(huán)胺的污染[3,56]。不同食品基質中雜環(huán)胺類化合物的典型檢測方法及其性能參數比較見表2。

表2 不同食品基質中雜環(huán)胺的典型檢測方法及性能參數Table 2 Typical analytical methods for determination of HAAs in various food matrices and their performances

續(xù)表2 不同食品基質中雜環(huán)胺的典型檢測方法及性能參數Continue table 2 Typical analytical methods for determination of HAAs in various food matrices and their performances

7 總結與展望

雜環(huán)胺是在富含蛋白質的食品加熱過程中自然形成的，它們的形成高度依賴于烹飪方法、水分含量、pH值和肌酐含量、食物種類等多種因素。目前，一些雜環(huán)胺的形成機制，如2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4，5-f]喹啉、2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉型雜環(huán)胺、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]-吡啶、1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚、9H-吡啶并[3，4-b]吲哚等已被闡明并被科學家廣泛接受。食品中雜環(huán)胺的提取凈化和分析檢測近年來也得到了廣泛報道，雖然使用液液萃取、固相萃取等前處理手段結合液相色譜法、超高液相色譜法、質譜法等現代分析技術對不同食品中的雜環(huán)胺進行檢測，但由于雜環(huán)胺在食品中的痕量存在以及食品基質的高度復雜性，未來一段時間內，雜環(huán)胺的精準分析和測定仍然是一項艱難的任務。這一難題只能通過精細化提取、高效純化和預濃縮步驟（如采用QuEChERS、分散固相萃取技術）相結合，然后采用串聯質譜法等高靈敏的檢測手段定量其痕量水平來解決。此外，還需要進一步的研究來尋找更快速的技術，從而更有效地識別這些污染物。除此之外，還需加強酒精飲料、焙烤食品等除肉制品以外的食品中雜環(huán)胺的分析檢測和暴露評估研究。