姜 山，時(shí) 爽，單萬亭，鞠愛霞，李秋紅

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

2019年末，一種新型冠狀病毒導(dǎo)致的肺炎在湖北武漢暴發(fā)，隨后蔓延至全國(guó)。此次發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒為β屬與2003年發(fā)現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus)和2012年發(fā)現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus)為同一種屬[1]，是繼HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV之后第七種已知的人類冠狀病毒。COVID-19的傳播能力強(qiáng)，途徑廣，可通過飛沫、接觸，以及密閉環(huán)境中可能通過氣溶膠傳播。人群普遍易感，輕癥患者多出現(xiàn)低熱、輕微乏力，無肺炎表現(xiàn)等癥狀；重者可快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征，引起代謝紊亂、休克、器官衰竭甚至死亡。

國(guó)家衛(wèi)健委指出，根據(jù)數(shù)據(jù)信息提示，總體上我國(guó)本輪疫情流行高峰已經(jīng)過去。但是，在世界范圍內(nèi)，COVID-19疫情仍十分嚴(yán)峻，多個(gè)國(guó)家相繼大范圍暴發(fā)，截至2020年3月10日24時(shí)，我國(guó)累計(jì)報(bào)告確診病例80 778例，境外確診病例已超3萬人，感染數(shù)量已經(jīng)超過了2003年SARS的暴發(fā)[2]。目前，仍未發(fā)現(xiàn)治療COVID-19的特效藥，我國(guó)主要采用中西醫(yī)結(jié)合的治療方法，西醫(yī)主要使用α-干擾素、利巴韋林等開展診療，中醫(yī)則以清肺排毒湯等根據(jù)病情、各地氣候特點(diǎn)以及患者體質(zhì)的不同辨證論治。

麻杏甘石湯出自張仲景所著的《傷寒論》中，方劑由15 g麻黃、15 g杏仁、10 g甘草、30 g石膏組成，本方主要是治療太陽病汗下后，邪氣內(nèi)傳于肺，肺熱奎滯，氣逆而喘，具有辛涼疏表、清肺平喘的功效，可廣泛用于治療外感發(fā)熱、肺炎咳喘、支氣管哮喘、肺氣腫等疾病[3]。國(guó)家衛(wèi)健委和國(guó)家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合發(fā)布的中藥復(fù)方清肺排毒湯中也包含麻杏甘石湯，方中麻黃為主藥，能發(fā)汗宣肺；重用石膏為輔，可清瀉肺熱；杏仁宣利肺氣為佐，助麻黃以止咳平喘；甘草調(diào)和諸藥為使[4]。麻杏甘石湯在治療呼吸道疾病的同時(shí)又有抗炎、抗流感病毒、調(diào)節(jié)免疫功能的作用[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)的理論，建立在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)新藥設(shè)計(jì)和藥物作用機(jī)制挖掘的學(xué)科。闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程，從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)。分子對(duì)接則是利用計(jì)算機(jī)模擬配體與受體蛋白結(jié)合，結(jié)合自由能表示結(jié)合能力的強(qiáng)弱，自由能越小表示配體和受體相互匹配作用越佳[6]。本研究預(yù)測(cè)麻杏甘石湯中的核心活性化合物，并對(duì)中藥-化合物-靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，為新藥研發(fā)及治療COVID-19提供依據(jù)。

1 方法

1.1 麻杏甘石湯活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/)獲取麻杏甘石湯中的成分信息，以“麻黃”“杏仁”“甘草”“石膏”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選條件OB≥30%，且DL≥0.18[7]的化學(xué)成分作為活性成分并收集相關(guān)靶標(biāo)蛋白。

1.2 C-T網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及PPI分析與麻杏甘石湯相關(guān)的所有靶標(biāo)均從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中收集，隨后通過將類型限制為“人源”，在UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取基因的正式名稱，借助Cytoscape3.7.1軟件建立C-T網(wǎng)絡(luò)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的活性化合物和靶點(diǎn)初步分析。將活性化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入STRING平臺(tái)(https://string-db.org/)，獲取蛋白相互作用的關(guān)系。

1.3 生物學(xué)及通路富集分析麻杏甘石湯的作用靶點(diǎn)使用GO富集和KEGG通路分析，基于注釋、可視化等模塊在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)。P<0.05提示富集具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且通路結(jié)果可能是麻杏甘石湯治療COVID-19的重要功能機(jī)制，得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用R軟件繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.4 分子對(duì)接分析分子對(duì)接的結(jié)合能為負(fù)表明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，研究選取結(jié)合能≤-5 kJ·mol-1的活性成分[8]作為麻杏甘石湯治療COVID-19靶點(diǎn)的篩選依據(jù)。選取SARS-CoV-2 3CL水解酶和 ACE2做為分子對(duì)接的靶蛋白，并借助PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)獲取3D結(jié)構(gòu)，使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載化合物的3D結(jié)構(gòu)保存為*mol2格式，TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)未找到的化合物用ChemOffice軟件構(gòu)建化合物的3D結(jié)構(gòu)并使其能量最小化作為分子對(duì)接配體。利用PyMOL軟件、Auto Dock軟件處理化合物及靶蛋白后用vina進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶蛋白的篩選根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18，篩選出化合物134個(gè)，其中23個(gè)來自麻黃，19個(gè)來自杏仁，92個(gè)來自甘草，石膏的化學(xué)成分并未在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到，部分活性化合物基本信息見Tab 1。

Tab 1 Basic information of active compounds of Maxingganshi decoction

2.2 C-T網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治鲋兴?化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)總共包括345個(gè)節(jié)點(diǎn)和1936條邊，網(wǎng)絡(luò)中紅色菱形、藍(lán)色三角形、綠色橢圓形、黃色平行四邊形、紫色六邊形、青色八邊形分別代表麻黃、杏仁、甘草、麻黃和杏仁共有、麻黃和甘草共有、杏仁和甘草共有的化合物，深黃色長(zhǎng)方形代表靶點(diǎn)(Fig 1)。通過分析化合物-靶點(diǎn)之間的中心度值、親中心度值以及等級(jí)值發(fā)現(xiàn)，排名在前6位的化合物分別是槲皮素、山奈酚、柚皮素、豆甾醇、木犀草素、甘草黃酮，分別能與274、104、64、54、51、42個(gè)靶點(diǎn)蛋白發(fā)生相互作用。靶點(diǎn)方面，排名前列的是PTGS2、ESR1、PPARG、AR、NOS2、NCOA2，分別能與108、84、75、74、72、65個(gè)化合物發(fā)生相互作用；從靶點(diǎn)相互作用的角度，排名靠前的是AKT1、MAPK3、IL6、VEGFA、JUN、CASP3、MAPK8，分別能與136、121、120、110、104、103、101個(gè)蛋白發(fā)生相互作用(Fig 2)。通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，麻杏甘石湯中所含化合物在不同中藥中均存在，借助Venny 2.1在線平臺(tái)繪制韋恩圖(Fig 3)，分析發(fā)現(xiàn)MOL000098槲皮素、MOL000422山奈酚、MOL004328柚皮素為麻黃和甘草所共有；MOL000449豆甾醇、MOL000492(+)-兒茶素為麻黃和杏仁所共有；MOL002311甘醇、MOL000359谷甾醇、MOL004841甘草查耳酮B、MOL000211丁子香萜、MOL004908甘草黃酮、MOL004903甘草苷、MOL005017菜豆酚為杏仁和甘草所共有。

Fig 1 Chinese medicine herb-compound-target network of Maxingganshi decoction

Fig 2 Number of adjacent nodes at target

Fig 3 Distribution of compounds in Maxingganshi decoction

2.3 靶點(diǎn)富集分析DAVID中GO功能富集分析得到GO條目226個(gè)(P<0.05)，其中生物過程(biological process, BP)條目165個(gè)，細(xì)胞組成(cellular component, CC)條目24個(gè)，分子功能(molecular function, MF)條目37個(gè)，分別占73%、10.6%、16.4%(Fig 4)。KEGG通路富集篩選得到65條信號(hào)通路(P<0.05)，涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用等，見Tab 2和Fig 5。

Tab 2 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.4 分子對(duì)接結(jié)果分析一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。分子對(duì)接結(jié)果顯示麻杏甘石湯中核心活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶有較好的結(jié)合活性，見Tab 3和Fig 6。

Tab 3 The binding affinities of core compounds of Maxingganshi decoction and clinical treatment drugs with SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2

Fig 4 GO enrichment analysis of targets of Maxingganshi decoction

Fig 5 Analysis of KEGG enrichment in 20 pathways as targets of Maxingganshi decoction

Fig 6 Molecular docking of SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2 with glabridin and kaempferolA: glabridin-SARS-CoV-2 3CL hydrolase; B: kaempferol-SARS-CoV-2 3CL hydrolase; C: glabridin-ACE2; D: kaempferol-ACE2

3 討論

目前，根據(jù)各地病例信息和臨床療效的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，中醫(yī)藥對(duì)于COVID-19的治療起到了重要的作用，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“正氣存內(nèi)，邪不可干”，在沒有特效藥的情況下，廣泛宣傳“治未病”的理念，未病先防，已病防變，提醒人們?cè)鰪?qiáng)自身免疫力，共同抗擊疫情。國(guó)家衛(wèi)健委已將新冠肺炎納入“疫病”的范疇，由感受疫癘之氣所致。新冠肺炎疫情具有強(qiáng)烈的傳染性和大面積流行的特征，屬于中醫(yī)上“瘟疫”的范疇。瘟疫是病毒通過口鼻侵入造成呼吸道感染而致病，導(dǎo)致肺部細(xì)胞受損，如若正氣不足免疫力低下則使病情加重，肺部細(xì)胞大量壞死，輕者發(fā)熱、咳嗽、咽痛、胸悶、氣促、喘息、乏力，重者肺部纖維化導(dǎo)致呼吸困難甚至衰竭，最終威脅生命[9]。中醫(yī)藥歷經(jīng)數(shù)代疾病，面對(duì)COVID-19的治療也有足夠的經(jīng)驗(yàn)，并在此次疫情中起到了很好的治療作用和不可替代的地位，通過分析中醫(yī)治療的推薦處方，可以在現(xiàn)階段對(duì)COVID-19的臨床治療處方中，明顯的看出是通過麻杏甘石湯的基礎(chǔ)方劑上進(jìn)行適當(dāng)改變用藥的。

麻杏甘石湯中麻黃可宣肺散寒，杏仁能宣散肺氣，甘草用于調(diào)和諸藥，石膏有清熱之功效，此方為千古以來治療風(fēng)溫肺熱病(肺炎)的主要方劑，針對(duì)表寒肺熱，可表里雙治。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析中發(fā)現(xiàn)，將麻杏甘石湯中綜合評(píng)分最高的6個(gè)化合物同目前臨床治療應(yīng)用的化學(xué)藥與SARS-CoV-2 3CL水解酶進(jìn)行分子對(duì)接研究，這些關(guān)鍵化學(xué)成分具有接近甚至超越化學(xué)藥的結(jié)合能力，特別是甘草黃酮和山奈酚均低于利巴韋林、利托那韋等化學(xué)藥的結(jié)合能。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SARS-CoV-2病毒是ACE2作為進(jìn)入受體，通過受體介導(dǎo)的胞吞作用感染肺泡上皮細(xì)胞而引起肺炎[10]。故將方劑中關(guān)鍵化學(xué)成分及西藥與ACE2進(jìn)行分子對(duì)接比較，結(jié)果顯示甘草黃酮的結(jié)合能為-28.42 kJ·mol-1，低于全部化學(xué)藥的結(jié)合能，其他關(guān)鍵化學(xué)成分的結(jié)合能也較化學(xué)藥相比有不同程度的降低。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)結(jié)果表明麻杏甘石湯對(duì)于治療COVID-19應(yīng)該有較好的療效。

通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)果大多涉及免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及與炎癥相關(guān)的通路，SARS-CoV-2病毒感染會(huì)引起劇烈的免疫及炎癥反應(yīng)，并激活大量細(xì)胞因子，其中Th17細(xì)胞的主要功能是促進(jìn)中性粒細(xì)胞的動(dòng)員、募集和活化，介導(dǎo)促炎癥反應(yīng)，一系列細(xì)胞因子如TGF-β、IL-6、IL-9、IL-1、IL-23、IL-21、IRF4、STAT3參與了Th17細(xì)胞分化過程[11]。IL-17是Th17細(xì)胞的關(guān)鍵效應(yīng)因子，能夠引起多種細(xì)胞合成并分泌IL-6、IL-8等細(xì)胞因子，使ICAM-1的表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生[12]。麻杏甘石湯的多靶標(biāo)可能是通過調(diào)控免疫相關(guān)通路以及細(xì)胞炎癥因子作用相關(guān)通路，對(duì)免疫以及炎癥反應(yīng)進(jìn)行抑制。

據(jù)載，生石膏主要應(yīng)用于外感熱病所致的肺熱咳喘，而且肺熱咳喘是COVID-19 的主要癥狀之一[13]。但其未收錄在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，故未收集此藥物。而其主要成分硫酸鈣與SARS-CoV-2 3CL 水解酶進(jìn)行分子對(duì)接，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想，因此硫酸鈣未納入麻杏甘石湯治療 COVID-19 的核心活性化合物。

綜上所述，我們通過對(duì)麻杏甘石湯網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)，麻杏甘石湯的治療作用可能是通過活性物質(zhì)對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制有關(guān)，如PI3K/AKT通路。有必要對(duì)麻杏甘石湯進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)研究，探討其關(guān)鍵作用機(jī)制。