夏 濤，王昌權(quán)，李 奎，覃小麗，王愛民，黃 勇，李月婷，鞏仔鵬，鄭 林

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1.貴州省藥物制劑重點實驗室/藥用植物功效與利用國家重點實驗室，2.藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004; 3.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)被認為是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的慢性、全身性自身免疫性疾病，常伴隨著關(guān)節(jié)破壞，軟骨和骨質(zhì)損傷，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量和健康[1]。RA的病因復(fù)雜，癥狀多樣，研究證實，其發(fā)病機制涉及抗原、免疫細胞(CD4+T 細胞)、細胞因子(TNF-α、IL-1β)等多種因素參與的一系列免疫反應(yīng)[2]。佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA) 模型臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)及病理反應(yīng)等方面類似于人的RA，是研究RA的經(jīng)典動物模型[3]。因此，選擇AA模型用于實驗研究。

黑骨藤為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨(PeriplocaforrestiiSchltr.)的干燥根或全株，常用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷等癥的治療，被收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》(2003 年版)中[4]。研究表明，黑骨藤能顯著降低AA模型大鼠的胸腺指數(shù)，提高腎臟、肝臟、脾臟指數(shù)，能有效降低AA模型大鼠血清、組織液中 IL-1、IL-6和TNF-α含量水平[5]；能顯著減緩AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜、軟骨組織的損傷，修復(fù)被破壞的組織，能在一定程度上減緩RA的發(fā)展[6]。課題組前期從黑骨藤提取物中分離鑒定了3-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡?；鼘幩?、5-O-咖啡?；鼘幩?、3，4-O-二咖啡?；鼘幩?、3，5-O-二咖啡?；鼘幩帷?，5-O-二咖啡?；鼘幩帷⒏芰拒?、杠柳苷元等化合物[7]。已有研究報道，黑骨藤提取物中咖啡?；鼘幩犷悊误w化合物對人RA成纖維樣滑膜細胞MH7A的增殖速度具有顯著的抑制作用，推測該類化合物可能通過抑制MAPK信號通路的激活，降低NF-κB活性，抑制下游炎癥因子表達而產(chǎn)生抗RA的作用[8-9]。但迄今為止，關(guān)于黑骨藤體內(nèi)過程的研究尚未見報道。且越來越多研究表明，病理狀態(tài)會改變中藥藥代動力學(xué)特征，對藥物的ADME過程產(chǎn)生一定影響[10]。因此，開展中藥多效應(yīng)成分在病理狀態(tài)下的藥代動力研究學(xué)，對于闡明中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)、指導(dǎo)臨床用藥安全、有效等具有重要意義。

鑒于此，在前期的工作基礎(chǔ)上，選擇黑骨藤提取物中3-O-咖啡?；鼘幩帷?-O-咖啡?；鼘幩岷?-O-咖啡?；鼘幩釣橹笜诵猿煞郑⒀獫{中同時測定3種成分的HPLC-MS/MS分析方法，開展黑骨藤提取物在AA模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，探究黑骨藤提取物的藥動學(xué)特征，為黑骨藤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及體內(nèi)過程提供參考，為黑骨藤的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑3-O-咖啡?；鼘幩釋φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201415，純度≥98%)；4-O-咖啡?；鼘幩幔?-O-咖啡?；鼘幩釋φ掌?四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為：AB7061002，AB7050442，純度均≥98%)；葛根素(江西佰草源生物科技有限公司，批號：BCY-0245，純度≥98%)；黑骨藤提取物(自制，批號：20171113)；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器高效液相色譜儀(日本島津公司)，AB5500質(zhì)譜(Analyst、MultiQuant工作站，美國AB公司)；Allegra 64R低溫高速離心機(美國Beckman 公司)；AE240 十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司) ；ZH-2渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠)；CQ 250A-TS超聲波清洗機(上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠)；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)。

1.3 實驗動物健康Sprague-Dawley大鼠，SPF級，♂，體質(zhì)量(200±20) g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK(黔)2018-0001，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(批準號1603125)。

1.4 溶液的配制

1.4.1對照品溶液的配制 精密稱取3種成分對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得3-O-咖啡?；鼘幩?1.114 g·L-1)，5-O-咖啡酰基奎寧酸(1.024 g·L-1)，4-O-咖啡?；鼘幩?1.086 g·L-1)等對照品儲備液。分別精密量取上述3種對照品儲備液100 μL于10 mL容量瓶中定容，用甲醇逐級稀釋得混合系列標準溶液，-20 ℃保存。

1.4.2內(nèi)標溶液配制 精密稱取葛根素適量于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得葛根素(1.011 g·L-1)儲備液，-20 ℃保存，備用。取內(nèi)標儲備液用甲醇配制成20.20 μg·L-1的內(nèi)標溶液。

1.4.3枸櫞酸鈉溶液配制 精密稱取0.32 g枸櫞酸鈉粉末，溶于生理鹽水中，定容至10 mL，得32 g·L-1枸櫞酸鈉溶液，4 ℃保存，備用。

1.4.4黑骨藤提取物制備 黑骨藤藥材30 kg，加8倍量70%乙醇提取2次，提取時間分別為1.5、1.0 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至1 000 g·L-1(以生藥計)，45 ℃真空干燥，即得，提取率7.68%。

1.5LC-MS/MS條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：ACEC18-PFP(150 mm×4.6 mm, 3 μm)；流動相：0.1%甲酸乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)，梯度洗脫(0～2 min，20%～40% B；2～5 min，40%～50% B；5～5.5 min，50% B；5.5～5.6 min，50%～90% B；5.6～7 min，90% B；7～7.1 min，90%～20% B；7.1～9 min，20% B)；流速：0.6 mL·min-1，柱溫：40 ℃，進樣器的溫度：15 ℃；進樣體積為1 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源(ESI-)，毛細管電離電壓：-4.5 kV，離子源溫度：550 ℃；噴霧氣與反吹氣：N2，離子源氣體1 ∶55 psi，離子源氣體2 ∶55 psi，掃描方式為MRM模式檢測，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為Analyst、MultiQuant工作站。3-O-咖啡?；鼘幩岬?種成分及內(nèi)標用于定量分析的監(jiān)測離子，見Tab 1。

Tab 1 Mass spectrometric conditions of three components

1.6 AA模型大鼠的制備取雄鼠8只，測定其足容積及踝關(guān)節(jié)周長作為基礎(chǔ)值，于每只大鼠右后足足墊皮內(nèi)注射0.1 mL CFA試劑，7 d后再次免疫，造模21 d。

1.7 血漿樣品的處理取各血漿樣品200 μL，置1.5 mL EP管中，補加甲醇100 μL，依次加入50 μL葛根素內(nèi)標溶液(20.20 μg·L-1)，10%甲酸水50 μL，渦旋混合(1 min)，加甲醇800 μL，渦旋混合(5 min)，超聲(10 min，100 kHz)，離心(12 000 r·min-1，10 min)，取上清液置離心管中，37 ℃下氮氣吹干。用初始流動相200 μL溶解，渦旋混合(5 min)，超聲(10 min，100 kHz)，離心(13 000 r·min-1，10 min)，取上清液置于進樣瓶中，照“1.5”項下的檢測條件分析。

1.8 動物給藥及血漿樣品采集于造模21 d后，選擇造模成功的SD大鼠8只，口服灌胃黑骨藤提取物87 g·kg-1(以生藥計)，給藥前12 h禁食，自由飲水。于末次給藥后5、15、30、45 min、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h經(jīng)尾靜脈取約0.3 mL的全血置涂有枸櫞酸鈉的1.5 mL塑料離心管中，6 000 r·min-1離心6 min，上清液用塑料離心管分裝，保存于-20 ℃冰箱中，備用。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察取大鼠空白血漿200 μL，除不加葛根素內(nèi)標外，其余按本部分“1.7”項下操作，獲得空白血漿樣品色譜圖A；將一定濃度標準溶液和內(nèi)標溶液加入空白血漿，依法操作，獲得相應(yīng)的標準品色譜圖B；取大鼠給藥后血漿，依法操作得相應(yīng)的樣品色譜圖C。由Fig 1可以看出，各成分間分離良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測成分的測定。

Fig 1 Typical HPLC-MS/MS chromatogramsA:Blank plasma;B:The rat plasma sample collected after i.g of Periploca forrestii Schltr extract to rats;C:Blank plasma spiked with three components 1.3-O-caffeoyl quinic acid 2.4-O-caffeoyl quinic acid 3.5-O-caffeoyl quinic acid 4. Puerarin(IS)

2.2 標準曲線和線性范圍考察取大鼠空白血漿200 μL，分別加入3個用甲醇按梯度稀釋的混合標準溶液100 μL，配制成相當于大鼠血漿藥物濃度見Tab 2，參照“1.7”項下操作。以待測物的峰面積與內(nèi)標峰面積之比(A/Ai)為縱坐標Y，各物質(zhì)濃度(C)為橫坐標X進行直線回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X，求得直線方程，即為標準曲線，結(jié)果見Tab 3。定量限(LOQ)定義為S/N≥10，檢測限(LOD)義為S/N≥3[11]。

Tab 2 Concentrations of three standard protocatechuate samples(μg·L-1)

Tab 3 Linar ranges and regression equations of 3-O-caffeoyl quinic acid,4-O-caffeoyl quinic acid,5-O-caffeoyl quinic acid

2.3 準確度和精密度考察按“2.2”項下分別配制3種成分大鼠血漿低、中、高(3-O-咖啡?；鼘幩釣?7.41、139.25、1 114.00 μg·L-1，4-O-咖啡?；鼘幩釣?6.97、135.75、1 086.00 μg·L-1，5-O-咖啡?；鼘幩釣?6、128、1 024 μg·L-1)3個濃度的血漿樣品，按“1.7”項下操作，每個濃度平行5份，日內(nèi)連續(xù)進樣，并與標準曲線同時進行。每個系列濃度做5份，計算日內(nèi)精密度；3種濃度連續(xù)測定3 d，計算日間精密度。結(jié)果表明3種成分的日內(nèi)和日間精密度RSD(%)均小于13%，準確度范圍為85.25%～99.30%，提示該方法準確、可靠、重現(xiàn)性好，符合生物樣品分析方法要求。

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察取大鼠空白血漿200 μL，按“2.2”項下分別配制低、中、高3個濃度的血漿樣品(濃度同2.3項下)，每個濃度平行5份，按“1.7”項下方法處理進樣分析，記錄峰面積為A；另取空白血漿200 μL，除不加混合標準溶液外，其余按“1.7”項下方法操作，向上清液中加入相應(yīng)低、中、高濃度的混合標準溶液和內(nèi)標，吹干，殘留物以200 μL初始流動相溶解，進樣分析記錄峰面積為B；另取上述低、中、高濃度的混合標準溶液與內(nèi)標，吹干，殘留物以200 μL初始流動相溶解，進樣分析記錄峰面積為C。計算提取回收率/%=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)/%=B/C×100%。結(jié)果表明3-O-咖啡?；鼘幩岬?種成分的提取回收率分別為：84.30%～109.45%、98.52%～111.94%、99.51%～111.55%，基質(zhì)效應(yīng)分別為：81.96%～101.35%、84.01%～86.84%、81.19%～87.52%，結(jié)果表明提取回收率符合生物樣品分析方法要求。

2.5 樣品穩(wěn)定性實驗按“2.2”項下分別配制3種成分的血漿低、中、高3個濃度(濃度同3.3項下)QC樣品，考察樣品處理后分別至室溫(約25 ℃)中，4 ℃下冷藏24 h，反復(fù)凍融(-20 ℃)3次，并在3種環(huán)境下的穩(wěn)定性，結(jié)果見Tab 4。結(jié)果表明血漿樣本上述處理條件下均穩(wěn)定，滿足生物樣品分析方法要求。

Tab 4 Stability(24 h at room temperature, 24 h storedat 4 ℃, Freeze-thaw cycles) of three components in rat

2.6 黑骨藤提取物在AA模型大鼠體內(nèi)藥動學(xué)比較研究AA模型大鼠口服黑骨藤提取物后，應(yīng)用建立的HPLC-MS/MS分析方法測定大鼠體內(nèi)3-O-咖啡酰基奎寧酸等3種成分的血藥濃度，平均血藥濃度-時間曲線見Fig 2。采用 WinNonlin 6.4軟件對藥物在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)過程進行非房室模型擬合并計算其相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)見Tab 5。

Tab 5 Pharmacokinetic parameters of three components after i.g of Periploca forrestii Schltr.

Fig 2 Concentration-time profiles of three components after i.g of Periploca forrestii Schltr.

3 討論

建立HPLC-MS/MS分析方法，采用ESI-1源、多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，同時測定AA模型大鼠血漿中3-O-咖啡?；鼘幩岬?種成分的濃度，該分析方法具有測定時間較短、專屬性好、內(nèi)源性干擾小等特點[12]，并將該分析方法成功地應(yīng)用于黑骨藤提取物的藥代動力學(xué)研究。預(yù)實驗中考察了生物樣品處理方法，最終確定先用10%的甲酸酸化血漿，再加入甲醇沉淀蛋白進行血漿樣品的處理，該方法得到的峰較尖銳、基線較平穩(wěn)，且回收率和基質(zhì)效應(yīng)滿足生物樣品的分析要求。

非房室模型假設(shè)藥物末端以單指數(shù)消除，不受房室模型的限制，適用于大多數(shù)藥物[13]。因此試驗采用藥動學(xué)軟件WinNonlin 6. 4的非房室模型處理數(shù)據(jù)，用時間-血漿濃度曲線下面積(AUC)、平均滯留時間(MRT)、達峰濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)、半衰期(t1/2)、表觀分布容積(V)、清除率(CL)等參數(shù)描述黑骨藤提取物中3-O-咖啡酰基奎寧酸等3個指標性成分在AA模型大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程。Cmax、Tmax是衡量藥物吸收程度和速率的主要參數(shù)，研究結(jié)果顯示，口服黑骨藤提取物后，3-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡酰基奎寧酸和5-O-咖啡?；鼘幩岬腡max均為1 h左右，3-O-咖啡酰基奎寧酸的Cmax較大；AUC是評價藥物吸收程度的一項重要指標，3-O-咖啡?；鼘幩岬腁UC較大；t1/2和MRT是衡量藥物在體內(nèi)消除快慢和速率的參數(shù)，3-O-咖啡?；鼘幩岬膖1/2為5.99 h，MRT為6.93 h，4-O-咖啡?；鼘幩岬膖1/2為7.35 h，MRT為6.93 h；5-O-咖啡?；鼘幩岬膖1/2為6.83 h，MRT為7.42 h。結(jié)果表明黑骨藤提取物在AA模型大鼠體內(nèi)吸收快，消除迅速，不容易在體內(nèi)蓄積。

本實驗建立了HPLC-MS/MS法測定黑骨藤提取物中3 個單咖啡?；鼘幩犷惓煞值难帩舛龋⒊晒?yīng)用于其藥動學(xué)研究，闡明 3 個單咖啡?；鼘幩犷惓煞值乃巹犹卣?，為黑骨藤藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及創(chuàng)新藥物研制、臨床合理應(yīng)用提供了一定理論基礎(chǔ)和參考。