3-取代吲哚酮類抗癌藥物對(duì)抗神經(jīng)退行性疾病之進(jìn)展

黃 凌，張?jiān)谲?，李銘源，韓怡凡，崔 巍

(1. 寧波市康寧醫(yī)院精神科，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315020；2. 暨南大學(xué)新藥研究院，廣東 廣州 510632；3. 澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，澳門 999078；4. 香港理工大學(xué)應(yīng)用生物與化學(xué)技術(shù)學(xué)系，香港 999077)

隨著人口老齡化的進(jìn)程，神經(jīng)退行性疾病已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后的第三大殺手，但是，對(duì)癥治療神經(jīng)退行性疾病的藥物尚未面世。目前臨床使用的治療藥物雖能減輕神經(jīng)退行性疾病癥狀，但無法阻止神經(jīng)元死亡。因此，急需研發(fā)能夠減慢或阻止疾病進(jìn)程的神經(jīng)保護(hù)藥物。

最近研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤和神經(jīng)退行性疾病具有相似的特征，如都是隨著年齡增長(zhǎng)，發(fā)病率上升的疾病，最近發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌等患者罹患阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)的比例更高，提示機(jī)體的某些信號(hào)通路可能同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)元有調(diào)控作用[1]。這使人們思考抗腫瘤藥物可否通過調(diào)節(jié)這些共有的信號(hào)通路阻止神經(jīng)退行性疾病[2]。研究發(fā)現(xiàn)臨床治療慢性髓性白血病和惡性胃腸道間質(zhì)腫瘤的Abl激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼可有效抑制線粒體功能障礙，阻止神經(jīng)毒性蛋白β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)產(chǎn)生，因此可能“老藥新用” 治療AD[3]。

3-取代吲哚酮類化合物也兼具抗腫瘤和抗神經(jīng)退行性疾病藥效。3-取代吲哚酮類化合物是含有吲哚-2酮母核結(jié)構(gòu)的雜環(huán)類化合物。1998年，SUGEN公司設(shè)計(jì)、合成了舒尼替尼、SU4312、SU5416等系列3-取代吲哚-2-酮類化合物。這些化合物可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合多種受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)的ATP結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而抑制RTK的功能。由于包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2、血小板衍化生長(zhǎng)因子受體在內(nèi)的多個(gè)RTK介導(dǎo)了腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，因此3-取代吲哚-2-酮類化合物可通過特異性抑制這些受體，阻止腫瘤生長(zhǎng)和血管新生，殺死腫瘤細(xì)胞。2006年，舒尼替尼被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)用于臨床治療腎細(xì)胞癌和胃腸間質(zhì)瘤，是首個(gè)被批準(zhǔn)用于治療兩種以上癌癥的藥物。SU4312、SU5416等也已進(jìn)入腫瘤治療的臨床實(shí)驗(yàn)。合成的3-取代吲哚酮類化合物還包括SU6668、GW5074等，但這些化合物由于特異性差、副作用強(qiáng)等原因未能進(jìn)入臨床癌癥治療。

有趣的是，多種天然產(chǎn)物也具有3-取代吲哚-2-酮結(jié)構(gòu)。上世紀(jì)七十年代，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所從青黛中提取了3-取代吲哚酮類天然產(chǎn)物——靛玉紅。靛玉紅有很強(qiáng)的新生血管抑制活性，能抑制腫瘤生長(zhǎng)，現(xiàn)已被中國(guó)藥監(jiān)局批準(zhǔn)用于治療慢性粒細(xì)胞白血病。近年來，許多靛玉紅衍生物如靛玉紅-3-肟、7-溴-靛玉紅-3-肟也顯示了良好的抗腫瘤效果，進(jìn)入臨床或臨床前實(shí)驗(yàn)(Fig 1)。本文嘗試從機(jī)制上探討3-取代吲哚酮類化合物對(duì)抗神經(jīng)退行性疾病的分子靶標(biāo)和作用機(jī)理，并展望了這類化合物“老藥新用”對(duì)抗神經(jīng)退行性疾病的可能性。

1 3-取代吲哚酮類化合物具有神經(jīng)保護(hù)活性，可能對(duì)抗神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病包括帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、AD、亨廷頓病和肌萎縮側(cè)索硬化癥等。這些疾病的主要特征是大腦和脊髓神經(jīng)元病理性喪失。由于神經(jīng)元難以再生，因此神經(jīng)損傷很難被逆轉(zhuǎn)，損傷后可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)漸進(jìn)性功能障礙。神經(jīng)退行性疾病的病因尚不清楚。一般認(rèn)為多個(gè)靶點(diǎn)聯(lián)合參與疾病發(fā)生發(fā)展：如遺傳、環(huán)境等多種因素通過氧化應(yīng)激、線粒體損傷、異常蛋白聚集等多種機(jī)制導(dǎo)致PD患者中腦多巴胺能神經(jīng)元退行性死亡，隨著多巴胺能神經(jīng)元減少，患者出現(xiàn)靜止性震顫、肌肉僵直、行動(dòng)遲緩等運(yùn)動(dòng)障礙[4]。AD病因假說包括Aβ毒性假說、tau蛋白過度磷酸化假說、膽堿能下降假說等[5]。隨著病程進(jìn)展，AD患者大腦膽堿能神經(jīng)元退行性丟失，出現(xiàn)漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語(yǔ)言障礙等癥狀[6]。

Tab 1 The neuroprotective mechanisms of 3-substitute indolines in treating neurodegenerative disorders

Fig 1 Chemical structures of representative 3-substitute indulines

近年來，包括我們的多個(gè)課題組分別獨(dú)立發(fā)現(xiàn)，3-取代吲哚酮類化合物在體外培養(yǎng)神經(jīng)元有顯著神經(jīng)保護(hù)作用。舒尼替尼、SU4312、SU5416在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞和小腦顆粒神經(jīng)元能阻止1-甲基-4苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+)誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[7]；舒尼替尼、GW5074可對(duì)抗撤鉀引起的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡[8]；靛玉紅-3-肟在PC12細(xì)胞能抑制6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡[9]。靛玉紅-3-肟、7-溴-靛玉紅-3-肟和舒尼替尼還能在SH-SY5Y細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞阻止Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。此外，藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示3-取代吲哚酮類化合物可以穿過血腦屏障，提示這些化合物可能有中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥理活性。

3-取代吲哚酮類化合物在多種神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物模型中也顯示了極強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)活性，阻止運(yùn)動(dòng)障礙和認(rèn)知損傷。SU4312、SU5416在斑馬魚中可抑制1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)障礙和中腦多巴胺能神經(jīng)元死亡，提示其可能用于PD治療[7, 8]；舒尼替尼可對(duì)抗東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知障礙[10]；靛玉紅-3-肟和7-溴-靛玉紅-3-肟能對(duì)抗側(cè)腦室注射Aβ誘導(dǎo)的AD小鼠認(rèn)知能力下降[11]；此外，靛玉紅和SU4312還能降低MPTP誘導(dǎo)的小鼠紋狀體單胺類神經(jīng)遞質(zhì)下降[12]，對(duì)抗海人藻酸誘導(dǎo)的紋狀體損傷[13]。這些研究均顯示3-取代吲哚酮類化合物具有在體神經(jīng)保護(hù)作用，可能用于治療AD、PD等神經(jīng)退行性疾病。

2 3-取代吲哚酮類化合物通過多靶點(diǎn)作用產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)

3-取代吲哚酮類化合物產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)是什么？是否與其RTK抑制活性有關(guān)？我們發(fā)現(xiàn)不具備3-取代吲哚-2酮結(jié)構(gòu)的RTK抑制劑并不能產(chǎn)生類似的神經(jīng)保護(hù)作用，提示3-取代吲哚酮類化合物神經(jīng)保護(hù)作用可能不依賴其RTK抑制活性，而是通過作用其他靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)[7]。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路是神經(jīng)元凋亡的重要調(diào)節(jié)通路，與神經(jīng)元退行性丟失密切相關(guān)。活化的JNK蛋白可磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的Ser63和Ser73位點(diǎn)，激活c-Jun，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。撤鉀或雙氧水刺激可通過激活JNK通路、磷酸化c-Jun，誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡；MPTP也可通過激活JNK通路誘導(dǎo)中腦多巴胺能神經(jīng)元死亡。JNK抑制劑可阻止這些刺激誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，顯示抑制JNK通路具有神經(jīng)保護(hù)作用。體外激酶活性實(shí)驗(yàn)顯示舒尼替尼、靛玉紅-3-肟等3-取代吲哚酮類化合物對(duì)JNK磷酸化有抑制作用。其中，靛玉紅-3-肟對(duì)JNK三個(gè)亞型(JNK1、JNK2和JNK3)的半抑制劑量(IC50)分別為0.8、1.4和1.0 μmol·L-1[14]。靛玉紅-3-肟在體外培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元可劑量依賴性阻斷撤鉀以及秋水仙堿誘導(dǎo)的JNK通路激活、阻止神經(jīng)元凋亡[8]。以上結(jié)果顯示抑制JNK通路可能是3-取代吲哚酮類化合物實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)的重要方式。

糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)也參與神經(jīng)元退行性死亡。GSK3β是Aβ、MPTP等神經(jīng)毒素產(chǎn)生毒性的關(guān)鍵激酶。這些神經(jīng)毒素通過改變GSK3β磷酸化狀態(tài)(抑制Ser9位點(diǎn)磷酸化、促進(jìn)Ser396位點(diǎn)磷酸化)，增加GSK3β活性，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。此外，GSK3β還可抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖。因此，GSK3β抑制劑可通過促進(jìn)神經(jīng)元存活和神經(jīng)干細(xì)胞分化聯(lián)合產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)。舒尼替尼、GW5074、靛玉紅、靛玉紅-3-肟等3-取代吲哚酮類化合物可直接抑制GSK3β。其中，靛玉紅對(duì)GSK3β的抑制有高度選擇性，可有效逆轉(zhuǎn)GSK3β活性增加誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化和細(xì)胞凋亡[15-16]。靛玉紅-3-肟抑制GSK3β的IC50更達(dá)22 nmol·L-1[17]。靛玉紅-3-肟通過降低GSK3β活性，阻止MPTP誘導(dǎo)的大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元死亡，改善動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力[11, 16]。6-溴-靛玉紅-3-肟可通過抑制GSK3β劑量依賴性地降低tau蛋白水平和tau蛋白的磷酸化，其IC50為1.5 μmol·L-1[18]。此外，靛玉紅-3-肟和7-溴-靛玉紅-3-肟可通過抑制GSK3β，降低Aβ誘導(dǎo)的tau蛋白異常磷酸化，阻止高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知障礙[17, 19-20]。因此，GSK3β也是3-取代吲哚酮類化合物神經(jīng)保護(hù)作用的重要靶標(biāo)。

細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白。其中CDK5在神經(jīng)退行性疾病中有重要作用。CDK5活性在AD、PD的嚙齒類模型顯著增加，活化的CDK5可通過促進(jìn)Aβ、tau、α-synuclein等疾病相關(guān)蛋白異常聚集，誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，促進(jìn)神經(jīng)元死亡。舒尼替尼、靛玉紅、靛玉紅-3-肟等3-取代吲哚酮類化合物均可直接抑制CDK5活性，其中，舒尼替尼抑制CDK5的IC50為4.2 μmol·L-1[21]。舒尼替尼在小鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞中可抑制HIV外膜糖蛋白gp120引起的CDK5活化，阻止神經(jīng)元死亡[21]。舒尼替尼在gp120轉(zhuǎn)基因小鼠還能阻止tau蛋白異常磷酸化，預(yù)防神經(jīng)元退行性死亡，提高動(dòng)物認(rèn)知能力[21]。靛玉紅-3-肟不僅是有效的CDK抑制劑，而且毒性低、分子量小、有較好的細(xì)胞膜通透性，可以改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，減少Aβ誘導(dǎo)的額顳葉皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡[11]。此外，舒尼替尼、靛玉紅-3-肟通過抑制CDK5，可阻止tau和DARPP-32等蛋白異常磷酸化，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)[11]。由此可見，CDK5也是3-取代吲哚酮類化合物實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)的重要靶點(diǎn)。

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(myocyte enhancer factor-2，MEF2)是促進(jìn)神經(jīng)元存活的重要轉(zhuǎn)錄因子。MEF2轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中，MEF2可被GSK3β、CDK5等激酶修飾。經(jīng)修飾的MEF2難以入核，無法執(zhí)行轉(zhuǎn)錄功能。Aβ、MPTP、6OHDA等神經(jīng)毒素可通過促進(jìn)MEF2失活誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。靛玉紅-3-肟等3-取代吲哚酮類化合物除直接抑制GSK3β、CDK5、JNK等激酶活性外，還能直接增強(qiáng)MEF2轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞存活[22]。SU4312可通過直接增強(qiáng)MEF2轉(zhuǎn)錄活性逆轉(zhuǎn)MPTP誘導(dǎo)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷，抑制氧化反應(yīng)，維持線粒體功能，阻止多巴胺及其代謝物的消耗，抑制大鼠運(yùn)動(dòng)能力下降[13]。

一氧化氮合酶(nitric oxidase synthase，NOS)在神經(jīng)元退行性死亡中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。神經(jīng)元性一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)過度激活可產(chǎn)生過量NO，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。Aβ誘導(dǎo)的內(nèi)源性NO水平升高是AD早期神經(jīng)元死亡的主要原因。NO還參與了MPP+/MPTP等PD相關(guān)神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。舒尼替尼、SU4312和SU5416在體外可直接抑制nNOS活性，IC50分別為9.6、22.7、19.0 μmol·L-1。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)顯示3-取代吲哚酮類化合物可能通過其吲哚-2-酮母核與nNOS的heme基團(tuán)相互作用，抑制nNOS。這些化合物在小腦顆粒神經(jīng)元可通過抑制nNOS活性，阻止撤鉀及MMP+等刺激誘導(dǎo)的NO水平上升和神經(jīng)元死亡[7, 23]。此外，靛玉紅-3-肟還可通過降低NO水平，阻止細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞損傷[24]。以上結(jié)果顯示3-取代吲哚酮類化合物可通過抑制nNOS、降低NO水平產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)。

我們最近研究還發(fā)現(xiàn)，3-取代吲哚酮類化合物可通過抑制神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程中重要蛋白發(fā)揮抗神經(jīng)退行性疾病的作用，如舒尼替尼可競(jìng)爭(zhēng)性抑制乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)，其IC50低于1 μmol·L-1，可有效阻止腦內(nèi)乙酰膽堿分解，對(duì)抗東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知障礙[12]。SU4312能選擇性抑制單胺氧化酶-B(monoamine oxidase-B，MAO-B)，其IC50值為0.2 μmol·L-1[13]。顯示這類化合物還可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。

3 3-取代吲哚酮類化合物可望發(fā)展為新型抗神經(jīng)退行性疾病藥物

綜上所述，3-取代吲哚酮類化合物可通過JNK、GSK-3β、CDK5、MEF2、nNOS、AChE、MAO-B等多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)(Fig 2)。由于神經(jīng)退行性疾病與多因素相關(guān)，傳統(tǒng)的單靶點(diǎn)藥物很難阻止神經(jīng)元死亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)因治療。3-取代吲哚酮類化合物這樣的多靶點(diǎn)神經(jīng)保護(hù)藥物可能是治療神經(jīng)退行性疾病的重要方向。另一方面臨床藥物安全性確定，且被臨床醫(yī)生熟知。因此在“老藥新用”的研發(fā)可免除毒理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)，較新藥研發(fā)大大縮短了成本和時(shí)間。3-取代吲哚酮類化合物作為臨床抗腫瘤藥物“老藥新用”開發(fā)為治療神經(jīng)退行性疾病具有極大的優(yōu)勢(shì)，對(duì)其神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制的進(jìn)一步研究有望獲得一類新型抗神經(jīng)退行性疾病藥物。

Fig 2 Main anti-neurodegeneration targets of 3-substituted indolones