煙堿對映異構(gòu)體手性分離方法研究進展

韓書磊，陳 歡，金光祥，付亞寧，劉 彤，王紅娟，侯宏衛(wèi)，胡清源

國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6 號 450001

煙堿是煙草中最重要的生物堿，一般占煙草中生物堿總量的95%以上，是煙草及煙草制品重要的品質(zhì)要素和標簽［1］。此外，煙堿還被用作殺蟲劑、實驗藥物及戒煙藥物中的活性成分［2-5］，而大多數(shù)商業(yè)化的煙堿均由煙草企業(yè)的副產(chǎn)品提取純化而來［6-7］。煙堿分子含有一個手性中心，即四氫吡咯環(huán)上的2 位碳原子，因此煙堿有兩個對映異構(gòu)體（Enantiomer，以下簡稱為對映體）：S-（-）-煙堿（左旋煙堿，l-nicotine）和R-（+）-煙堿（右旋煙堿，d-nicotine）（圖1）。傳統(tǒng)的煙草制品，如卷煙、無煙氣煙草制品等的R-（+）-煙堿比例一般在1%以下，而在卷煙煙氣中可達3%左右［6，8-9］。煙草及煙草制品所含煙堿的主導(dǎo)構(gòu)型是S-（-）-煙堿，但近年來，隨著合成煙堿（消旋體煙堿）在電子煙等新型煙草制品中的應(yīng)用，煙堿對映體越來越受到人們的關(guān)注［10］。

對映體的物理化學性質(zhì)類似，但生理生化作用往往不同［11-12］。盡管相關(guān)研究尚不充分，但有限的研究結(jié)果表明，R-（+）-煙堿的藥理作用強度低于或類似于S-（-）-煙堿［13］，包括毒性［14-17］、生物代謝［18-19］、與乙酰膽堿受體（AChR）的結(jié)合［13］等。對映體化合物的手性分析是研究目標物藥理學及毒性等生理作用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵［20］。煙堿對映體手性分離可追溯到20 世紀70 年代，方法主要包括液相色譜（LC）法、超臨界流體色譜（SFC）法、氣相色譜（GC）法、毛細管電泳（CE）法和核磁共振（NMR）法等，但國內(nèi)外尚未見相關(guān)綜述報道。因此，歸納總結(jié)了國內(nèi)外近40 年的相關(guān)文獻，對各分離方法進行了討論，并對該領(lǐng)域以后的發(fā)展作了展望，以期為煙堿對映體的研究及應(yīng)用提供參考。

圖1 煙堿對映異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of nicotine enantiomers

1 液相色譜（LC）法

目前，LC 法在包括煙堿在內(nèi)的手性化合物分析領(lǐng)域研究最多、應(yīng)用最廣泛。LC 法分析手性化合物大多分為直接法和間接法，直接法包括手性固定相法、手性流動相添加劑法，間接法主要是手性衍生化試劑法。手性固定相（Chiral stationary phase，CSP）法是指分析物與手性固定相表面的手性選擇劑直接作用，對映體根據(jù)CSP 手性選擇區(qū)域識別能力的不同而表現(xiàn)出不同的保留行為，從而實現(xiàn)手性分離，是目前LC 手性分離中最常用、最重要的一種方法。CSP 法具有快速、靈敏、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，其固定相的選擇范圍廣，在手性分離方面發(fā)揮著越來越重要的作用，但其缺點是手性柱的成本相對較高，且一般一種手性色譜柱不能適用于多種對映體化合物的拆分［21］。目前，煙堿的LC 手性分析方法主要是CSP 法，手性選擇劑根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可分為多糖類、環(huán)糊精類、蛋白質(zhì)類、合成聚合物類、Pirkle 型（刷型）、大環(huán)抗生素類和冠醚類等［22］，而迄今為止用于煙堿手性分離的CSP 主要是多糖類［7，22-23］，其次是大環(huán)抗生素類［10，23］、環(huán)糊精類［24-25］、蛋白質(zhì)類［26-27］和合成聚合物類［28］等。

1.1 多糖類CSP 法

多糖類CSP 法對多種結(jié)構(gòu)手性化合物均適用，是目前LC 手性分離和制備中應(yīng)用最廣泛的一類CSP 法［29］。目前，多糖類CSP 法所應(yīng)用CSP 的主要類型是纖維素。纖維素類多糖是D-（+）-葡萄糖單元通過β-1，4-糖苷鍵相連接形成的具有光學活性的生物聚合物。由于葡萄糖單元的手性，纖維素本身具有手性識別能力，但由于天然纖維素分離能力不高，溶解性差，其應(yīng)用受到限制，一般不直接用作固定相。纖維素經(jīng)衍生化后，其手性識別能力顯著提高，衍生化方式包括酯化或醚化等，手性識別機理包括π-π、氫鍵、偶極-偶極及空間位阻等作用［30-31］。已報道的用于煙堿手性分離的典型衍生化試劑包括苯甲酸酯（CTB）類及取代苯基氨基甲酸酯（CTPC）類等，因結(jié)構(gòu)中引入苯環(huán)基團而使手性識別能力大大提高（圖2）。

纖維素（衍生物）類CSP 法主要分為兩種：涂覆型和鍵合型。涂覆型CSP 法利用沉淀法或蒸發(fā)溶劑法把溶于有機溶劑的纖維素衍生物涂覆在載體（如硅膠）表面，具有很好的手性識別能力，且耐高壓，是最常用的CSP 法。鍵合型CSP 法利用化學反應(yīng)將纖維素衍生物連接到載體上，其穩(wěn)定性較高，溶劑使用無限制（正相、反相皆可），可與包括質(zhì)譜在內(nèi)的多種檢測器串聯(lián)使用，且使用壽命相對較長，可修復(fù)再生，但其手性識別能力通常略差于同類涂覆型CSP 法。

圖2 纖維素三取代苯甲酸酯類及三取代苯基氨基甲酸酯類衍生物的結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of cellulose trisbenzoates and trisphenylcarbamates

用于煙堿手性分離的多糖衍生物涂覆型LC柱主要包括Chiralcel OJ［固定相為硅膠表面涂覆有纖維素三（4-甲基苯甲酸）酯］［6，32］、Chiralcel OD/OD-H［固定相為硅膠表面涂覆有纖維素三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸）酯］［7，22-23］等。該類色譜柱應(yīng)用范圍較廣，適合在正相流動相中使用，選擇性高；但缺點是溶劑耐受性差，流動相選擇有限，不與質(zhì)譜兼容等。

1998 年，Tang 等［32］報道了首次同時實現(xiàn)煙堿及降煙堿手性分離的HPLC 法。研究發(fā)現(xiàn)，Chiralcel OJ色譜柱（250 mm×4.6 mm×10 μm）的分離效果優(yōu)于Chiralcel OD柱（250 mm×4.6 mm×10 μm），優(yōu)化條件下，Chiralcel OJ 色譜柱流動相正己烷∶甲醇∶三氟乙酸=95∶4.98∶0.02，流速為1.0 mL/min，檢測器為二極管陣列檢測器（DAD），檢測波長為254 nm，分析時間為40 min。同年，Armstrong 等［6］建立了LC 法測定煙堿手性組成的方法，并分析了無煙氣煙草制品、煙葉、煙堿貼片及商品化煙堿純品的煙堿對映體組成。采用兩套液相分析系統(tǒng)：第一套為非手性半制備系統(tǒng)，色譜柱為Astec 半制備LC 柱（250 mm×10 mm×5 μm），流動相甲醇∶正己烷=80∶20，流速為2.0 mL/min，UV 檢測器檢測波長為254 nm，分析時間為24 min；第二套為手性分析系統(tǒng)，色譜柱為Chiralcel OJ 柱（250 mm×10 mm×5 μm），流動相正己烷∶甲醇∶三氟乙酸∶三乙胺=85∶15∶0.075∶0.0375，流速為1.0 mL/min，UV 檢測器檢測波長為254 nm，分析時間為15 min。該方法的樣品前處理采用甲醇超聲萃取法，第一套分析系統(tǒng)進樣量為100 μL，收集約2 mL 餾分后，氮吹濃縮至100 μL后進入第二套分析系統(tǒng)，進樣量為5～10 μL。結(jié)果表明，在8 種無煙氣煙草制品、3 種煙葉、8 種煙堿貼片及4 種商品化煙堿純品中檢測到0.1%～1.2%的R-（+）-煙堿（相對于煙堿總量），檢測到最高R-（+）-煙堿比例的樣品為煙堿貼片；另外，生物堿的質(zhì)量分數(shù)S-（-）-煙堿最高，其次為R-（+）-煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿。

2001 年，Mesnard 等［33］利用正相HPLC 法研究了煙堿對映體在白花丹葉煙草細胞懸液培養(yǎng)過程的降解動力學，發(fā)現(xiàn)R-（+）-煙堿比S-（-）-煙堿的降解速率快。儀器分析條件：Chiracel OD-H 色譜柱（150 mm×4.6 mm），流動相正己烷∶甲醇=95∶5，流速為0.5 mL/min，檢測波長為254 nm，S-（-）-和R-（+）-煙堿的出峰時間分別為7.5 和8.2 min。

2018 年，Zhang 等［8］建立了正相HPLC 測定煙葉、卷煙煙絲、無煙氣煙草制品及電子煙煙液中煙堿對映體比例的方法，分析條件：Chiralcel OD-H色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相正己烷∶甲醇=98∶2，流速為1 mL/min，UV 檢測器檢測波長為252 nm。S-（-）-和R-（+）-煙堿的基線可在15 min內(nèi)實現(xiàn)分離，其出峰時間分別為7.98 和9.21 min。結(jié)果表明，無煙氣煙草制品、卷煙煙絲、煙葉等含有來源于煙草煙堿產(chǎn)品的R-（+）-煙堿比例為0.02%～0.76%，含有合成煙堿的電子煙煙液中為49.89%。目前，該方法已成為國內(nèi)煙草行業(yè)測定煙草中煙堿對映體比例的標準方法，用于常規(guī)檢測［34］。

多糖衍生物鍵合型CSP 法的出現(xiàn)彌補了涂覆型CSP 法的缺點，擴大了多糖類CSP 的應(yīng)用范圍。用于煙堿手性分離的多糖衍生物鍵合型LC柱研究較少，如CHIRALPAK-IC［固定相為表面共價鍵合纖維素三（3，5-二氯苯基氨基甲酸）酯的硅膠］［35］。2018 年，余晶晶等［33］建立了HPLC-DAD法分離分析煙草與煙草制品中煙堿對映體的方法。該方法選用CHIRALPAK-IC 色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相正己烷∶異丙醇=95∶5（含有0.1%二乙胺），流速為1.0 mL/min，檢測波長為261 nm，樣品中目標物檢測限為0.02 mg/g。測定26 個不同類型煙草及煙草制品的煙堿對映體后發(fā)現(xiàn)，煙草中主要為S-（-）-煙堿，僅在6 個樣品中檢出R-（+）-煙堿，且R-（+）-煙堿占煙堿總量的比例為0.18%～0.70%，10 個成品卷煙煙絲及其主流煙氣中，主流煙氣中R-（+）-煙堿占煙堿總量的質(zhì)量比（2.08%～3.19%）明顯高于卷煙煙絲。

1.2 大環(huán)抗生素類CSP 法

Armstrong 等［36］于1994 年首次將大環(huán)糖肽類抗生素作為手性選擇劑應(yīng)用于液相色譜CSP，從此，該類CSP 被廣泛應(yīng)用。該類固定相在色譜分離中可用于正相及反相模式，同時還具有拆分范圍廣、手性識別能力強等優(yōu)點。用于煙堿手性分離的大環(huán)抗生素類LC 柱主要是NicoShell［固定相為鍵合改性大環(huán)糖肽的表面多孔微粒（SPPs）］［10，23］，該類型手性柱的分離能力較強，且分析時間短。

2017 年，Hellinghausen 等［10］建立了LC 法測定電子煙煙液、膠基型口含煙、戒煙貼及無煙氣煙草制品等中煙堿對映體比例的方法。選用NicoShell色譜柱（100 mm×4.6 mm），DAD 用于定量，檢測波長為263 nm，圓二色檢測器（CDD）及串聯(lián)質(zhì)譜檢測器（MS/MS）用于定性確認，色譜的流動相為0.1%的三氟乙酸銨甲醇溶液，流速為1 mL/min。在優(yōu)化條件下，可實現(xiàn)煙堿對映體的基線分離，分離度（R）為3.0，出峰時間＜3 min，檢出限為0.7 ng/mL。結(jié)果表明，含有來源于煙草煙堿產(chǎn)品的R-（+）-煙堿比例為0.5%～1.1%，含有合成煙堿的電子煙煙液中均為50%。2018 年，該團隊又建立了手性分離40種煙草生物堿及TSNAs 的LC-MS 方法［23］。其中，煙堿對映體的分離條件：NicoShell 色譜柱（100 mm×4.6 mm×5 μm），流動相為0.2%的甲酸銨甲醇溶液，流速為1 mL/min，在該條件下煙堿對映體可在3 min 內(nèi)得到基線分離，分離度為3.0。

1.3 環(huán)糊精類CSP 法

環(huán)糊精類CSP 法主要用于分離含有可被環(huán)糊精空腔包合的基團以及可形成氫鍵側(cè)鏈的化合物，在煙堿手性分離的應(yīng)用相對較少，且效果不理想。1987 年，Armstrong 等［24］報道了首例拆分煙堿對映體的LC 法，色譜柱為自制的鍵合有β-環(huán)糊精的硅膠填充型微柱（1 m×0.25 mm×5 μm）［37］，并使用含有飽和β-環(huán)糊精的手性流動相（正己烷∶甲醇=20∶80），流速為1.3 μL/min，檢測波長為254 nm。對煙堿對映體的分離度達1.7，能實現(xiàn)基線分離，但該法分析時間較長（5 h），柱壓高（2.3×107Pa），且分析柱需要自制，方法難以普及。1988 年，該團隊［25］研究了β-環(huán)糊精鍵合的LC 柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）對煙堿及19 種煙堿衍生物的分離效能，考察了流動相pH 和組成及目標物的結(jié)構(gòu)（取代基的位置和大小、吡咯環(huán)或氫鍵作用、堿性等）對目標物分離效果的影響，并成功分離10 種異構(gòu)體，但包括煙堿在內(nèi)的9 種對映體分離效果不理想。

1.4 蛋白質(zhì)類CSP 法

蛋白質(zhì)類CSP 含有大量手性中心，手性選擇能力強，適用于分析胺類和酸性目標物。1993 年，Demetriou 等［26］建立了測定煙堿對映體比例的LC法，檢測器為DAD，色譜柱為手性AGP 分析柱（100 mm×4.0 mm×5 μm），色譜柱填料為α-酸性糖蛋白（alpha-Acid glycoprotein）；流動相采用梯度洗脫模式，流動相A 為K2HPO（4100 mmol/L）和癸酸（4.5 mmol/L）水溶液，流動相B 為甲醇，流動相在進入分析柱之前需要通過一根預(yù)柱（100 mm×5.0 mm）引入飽和硅膠，流速為0.9 mL/min，柱溫為50 ℃，出峰時間＜10 min。該方法能實現(xiàn)煙堿對映體的基線分離，S-（-）-和R-（+）-煙堿的檢出限分別為0.2 和0.1 μg·mL-1。2019 年，Ji 等［27］建立了UPLC-MS/MS 測定煙草和煙草制品中生物堿對映體比例的方法，其中，煙堿分離條件：CHIRALPAK AGP 色譜柱（100 mm×4.0 mm×5 μ m），并串聯(lián)LUX-Cellulose-2 手性色譜柱［150 mm×2.0 mm×3 μm，手性固定相為纖維素三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸）酯］，流動相為30 mmol/L 甲酸銨溶液（溶劑0.3%氨水∶甲醇=90∶10），流速為0.4 mL/min，該條件下煙堿對映體在10 min 左右得到基線分離，其檢出限為5.4～8.4 ng/mL。

1.5 合成聚合物類CSP

合成聚合物類CSP 主要有聚酰胺類、聚氨酯類、聚苯乙烯等，其手性拆分的機理主要來源于聚合物的螺旋形結(jié)構(gòu)，但該方法在煙堿手性拆分領(lǐng)域的應(yīng)用較少。1991 年，Perfetti 等［28］建立了在線測定煙堿對映體比例的LC 法，該方法使用的色譜柱填料為聚苯乙烯-二乙烯基苯（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相的水相∶有機相=78∶22，其中，水相為0.2%磷酸溶液（溶劑水∶異丙醇=99∶1），并用三乙胺調(diào)節(jié)pH 至7.2，有機相乙腈∶異丙醇=99∶1，流速為1.0 mL/min，檢測器為旋光檢測器（Chiral monitor，定量）和UV 檢測器（定性）。該方法的檢出限為12 μg［R-（+）-煙堿最低比例為0.5%］，但其準確性和可靠性不足［38］。

2 超臨界流體色譜（SFC）法

超臨界流體色譜（Supercritical fluid chromatography，SFC），也叫合相色譜，是20 世紀80 年代逐漸發(fā)展和完善起來的一種以超臨界流體作為流動相的色譜分析技術(shù)［39］，具有簡單、快速、高效、經(jīng)濟和環(huán)保的特點，與質(zhì)譜聯(lián)用可進一步提高靈敏度和準確度，在化合物手性拆分中的應(yīng)用越來越多，近年來成功應(yīng)用于煙堿的手性分離。

2017 年，張洪非等［40-41］公開了一種手性拆分煙草及煙草制品、電子煙煙液等產(chǎn)品中煙堿的手性SFC-MS/MS 法。該方法已成為國內(nèi)煙草行業(yè)測定煙草中煙堿對映體比例的標準方法，用于樣品中煙堿對映體比例的確證檢測［32］。該方法采用串聯(lián)手性柱，分析柱1 為Trefoil CEL1 液相色譜柱（150 mm×3.0 mm×2.5 μm），分析柱2 為Chiralcel OD-H 液相色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相A 為CO2，流動相B 為含0.05%異丙胺的甲醇溶液，流速為1.1 mL/min，柱溫為40 ℃，分析時間總計12 min，方法檢出限為0.04%R-（+）-煙堿峰面積相對于總煙堿峰面積。

2019 年，Roy 等［42］報道表面多孔顆粒（SPPs）在SFC 手性分離中的應(yīng)用，并成功用于煙堿手性分離，分離條件：NicoShell 手性色譜柱（100 mm×4.6 mm×2.7 μm），流動相CO2∶甲醇=60∶40（含有0.1%二乙胺），流速為4 mL/min，柱溫為30 ℃，UV檢測器。目標物可在3 min 內(nèi)分離，且能達到基線分離（分離度為3.40）。

3 氣相色譜（GC）法

煙堿是半揮發(fā)性化合物，適合GC 法進行手性分析，且GC 法是國內(nèi)外煙草及煙草制品、卷煙煙氣等中煙堿質(zhì)量分數(shù)或釋放量分析的通用方法，兼容性好［43-45］。GC 法進行煙堿手性分析的檢測器主要有氮磷檢測器（NPD）、氫火焰離子化檢測器（FID）和質(zhì)譜檢測器（MS），按照分離原理不同主要分為兩類：手性衍生化法和手性固定相法。

3.1 手性衍生化法

手性衍生化法又稱間接拆分法，是指手性衍生化試劑與需要拆分的對映體發(fā)生化學反應(yīng)生成非對映異構(gòu)體，然后利用其物理或化學性質(zhì)的不同在非手性色譜柱上進行分離，其優(yōu)點是可使用已有的非手性GC 柱，花費少，分離時間相對較短，并可選用特定手性試劑以提高檢測靈敏度，其缺點是衍生化過程費時費力，對衍生化試劑要求高，且被分析物需有可衍生化的基團［46］。目前，基于該方法的文獻報道僅有1 篇，即1988 年，Peyton等［19］建立的GC-NPD 測定煙堿手性純度的方法：煙堿先與間氯過氧苯甲酸反應(yīng)生成煙堿氮氧化物，后者與硫酸亞鐵反應(yīng)生成降煙堿，降煙堿再與（-）-莰烷酰氯反應(yīng)生成煙堿酰胺衍生物，該衍生物可在SE-54 熔融石英彈性毛細管柱（30 m×0.2 mm）上得到分離，R-（+）-和S-（-）-煙堿的出峰時間分別為8.41 和8.67 min。

3.2 手性固定相法

手性固定相法，顧名思義，是指采用手性固定相進行目標物手性分離的方法。按照分離機制，主要分為3 種：①通過氫鍵作用實現(xiàn)分離的固定相，如氨基酸類；②通過包合作用實現(xiàn)分離的固定相，如環(huán)糊精（CD）類；③通過配位作用實現(xiàn)分離的固定相，如手性金屬配合物。目前用于煙堿手性分離的CSP 主要為CD 類。CD 類一般由6～12個葡萄糖單元組成，最常見的是α-、β-和γ-環(huán)糊精，分別有6、7 和8 個葡萄糖單元，其手性識別作用機理主要是空腔內(nèi)疏水基團對目標分子的包合作用及空腔外殼羥基與對映體分子的氫鍵作用（圖3）。該方法的優(yōu)點是不需要復(fù)雜的樣品衍生化過程，缺點是環(huán)糊精為固定相的GC 柱對煙堿對映體的分離效果不理想，靈敏度不高，分析時間較長（一般需要2 h 以上），且一根色譜柱的分離效果更不理想，為了提高分離效果，往往需要兩根色譜柱進行串聯(lián)［45］或進行多維GC 分析［9，46］。

圖3 環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)［47］Fig.3 Chemical structures of cyclodextrin

1998 年，Perfetti 等［48］建立了GC-MS 測定煙堿對映體的方法，并分析了煙草種子、再造煙葉、煙葉（白肋煙、烤煙等）及卷煙煙氣中的煙堿對映體，該法采用一種死體積較低的迷你連接組件串聯(lián)兩根GC 柱，第一根是Cyclodex-B 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），第二根是Rt-BDEXsm色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），目標物出峰時間約為160 min，色譜分析時間約為190 min，對R-（+）-煙堿的定量限為2.5%。結(jié)果表明，卷煙煙氣中R-（+）-煙堿的比例為2.6%～3.4%，但其他樣品均低于定量限。

2008 年，Liu 等［9，49］建立了測定煙草和卷煙煙氣中煙堿手性組成的中心切割-多維氣相色譜方（MDGC）法，其中，一維色譜柱為DB-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm），檢測器為FID；二維色譜柱為DB-Cyclodex-B（60 m×0.25 mm×0.25 μm），手性固定相是10.5%全甲基化β-環(huán)糊精分散于DB-1701色譜柱，檢測器為NPD。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)煙堿對映體的基線分離，目標物出峰時間為150 min，分析時間為170 min，方法對R-（+）-煙堿的檢出限為0.5%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分煙葉及卷煙煙絲樣品中的R-（+）-煙堿低于檢出限，而主流煙氣中的R-（+）-煙堿為2.6%～3.6%。

2010 年，Clayton 等［50］采 用GC-MS 法 分 析 了S-（-）-煙堿的熱裂解行為，色譜柱為含有10.5%β-CD 的Cyclodex-B 手 性 毛 細 管GC 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），運行時間約為115 min，但是該條件下煙堿對映體沒有得到基線分離。研究結(jié)果表明，在一定溫度范圍（200～1 000 ℃）內(nèi)，R-（+）-煙堿在總煙堿中的比例基本保持不變（約3%），故推測卷煙煙氣中R-（+）-煙堿比例增高的原因可能是S-（-）-煙堿與煙氣中其他未知成分發(fā)生了復(fù)雜反應(yīng)，但Liu等［49］認為，卷煙煙氣中R-（+）-煙堿比例增高是因為S-（-）-煙堿在高溫時的消旋化。

4 毛細管電泳（CE）法

CE 法是20 世紀80 年代初期由傳統(tǒng)電泳技術(shù)與色譜技術(shù)結(jié)合發(fā)展起來的［50］。該技術(shù)操作簡便，分離模式多樣化，分離效率高，近年來被廣泛應(yīng)用于實際樣品目標物的手性分離，但該技術(shù)也存在許多缺陷，如靈敏度低、檢測窗口窄、涂層材料自身存在紫外吸收、光散射產(chǎn)生背景干擾及手性識別機理研究較薄弱等，在煙堿手性分離方面研究很少，僅有1 篇文獻報道［51］。2009 年，Kodama等［52］利用CE 實現(xiàn)了煙堿、可替寧、降煙堿、假木賊堿和新煙草堿的手性分離，并測定了卷煙煙絲和煙氣中目標物的質(zhì)量分數(shù)或釋放量。該方法采用涂覆有氨基基團的毛細管柱為分析柱，以8%硫酸化β-CD 為手性選擇劑，電壓為+15 kV，溫度為30 ℃，檢測波長為260 nm。該方法檢測時間＜1 h，對S-（-）-和R-（+）-煙堿的檢出限均為0.3 mg/L。研究結(jié)果表明，在卷煙煙絲中僅檢測到S-（-）-煙堿（占煙堿總質(zhì)量的99.9%以上），而煙氣中S-（-）-和R-（+）-煙堿的質(zhì)量比為96∶4。

5 核磁共振（NMR）法

互為對映體的兩個化合物難以直接通過NMR譜區(qū)分，但對映體處于不對稱環(huán)境中，形成非對映異構(gòu)關(guān)系時可能產(chǎn)生化學位移的不等價，從而使相應(yīng)基團的NMR 信號分開［53］。目前，NMR 技術(shù)主要用于分析煙堿對映體純度，其方法主要是在對映體混合物中加入手性位移試劑或手性絡(luò)合劑，從而提供一個外部非對映環(huán)境。其缺點是分析時間較長，靈敏度較低，需要分離出純度較高的煙堿，難以直接用于煙草和煙草制品中煙堿對映體比例的測定；此外，NMR 儀價格較高，普及難度大。

1994 年，Jaroszewski 等［5］建立了13C NMR 法測定樣品中煙堿對映體比例的方法，該方法使用三氟乙酰樟腦酸鐿［Yb（tfc）3］為鑭系位移試劑（與煙堿摩爾比為0.15～0.20∶1），在100.6 MHz 下測定煙堿2'-C 原子的NMR 響應(yīng)值，并根據(jù)S-（-）-和R-（+）-煙堿2'-C 原子化學位移的不同，通過峰高進行定量。該方法定量限不低于1%［R-（+）-煙堿占總煙堿比例］，需要煙堿量為1～3 mg，根據(jù)目標物中R-（+）-煙堿比例不同，分析時間從1～2 h 到過夜不等；但是作者沒有給出樣品中煙堿對映體的比例，其原因可能是該方法的靈敏度比較低。1996 年，Ravard 等［54］使用（-）-（R）-1，1'-聯(lián)萘-2，2'-二基磷酸氫酯（BNPPA）為手性絡(luò)合劑，建立了測定包括煙堿在內(nèi)的煙草生物堿及類煙堿化合物手性純度的方法。在2 倍BNPPA 作用下，S-（-）-和R-（+）-煙堿吡啶基5-H 原子的化學位移分別為6.85 和7.08，能得到較好分離，且與偏振法（Polarimetric method）的測試結(jié)果一致性較好，適合測定純煙堿的手性純度。

綜上，煙堿對映體手性分離方法見表1。

表1 煙堿對映體手性分離方法及其特征①Tab.1 Chiral separation methods and their characteristics on nicotine enantiomers

表1 （續(xù)）

6 小結(jié)與展望

歸納和綜述近40 年國內(nèi)外煙堿對映體手性分離的文獻發(fā)現(xiàn)：①氣相色譜法、毛細管電泳法、核磁共振法等均可用于煙堿的手性分離，但從文獻數(shù)量、分離效率及應(yīng)用前景等方面分析，基于多糖類及大環(huán)抗生素類手性固定相的液相色譜法具有獨特優(yōu)勢，在手性分離及制備等方面應(yīng)用較廣泛；②超臨界流體色譜-質(zhì)譜法具有快速、高效、靈敏、環(huán)保等優(yōu)點，可作為液相色譜法的重要補充。

煙堿對映體手性分離未來的研究方向包括：①開發(fā)基于更高效、更廉價新型手性固定相的液相及氣相色譜柱；②研究更高效、更經(jīng)濟環(huán)保的手性分離技術(shù)，如超高效液相色譜法（UHPLC）、納米液相色譜法（nano-LC）等；③利用煙堿手性分離技術(shù)，開展S-（-）-及R-（+）-煙堿及消旋煙堿的生理效應(yīng)差異研究。