李浩，于華杰，李勝,,4，韓露，沈陽洋△

(1.山東省藥物研究院，濟南 250062；2.山東省腫瘤防治研究院，濟南 250117；3.濟南大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟南 250220；4.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，濟南 250062)

1 引 言

隨著發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升，在我國，癌癥已經(jīng)成為最主要的疾病死亡原因[1]。研究表明早期診斷和早期治療與癌癥預(yù)后密切相關(guān)[2]。多數(shù)癌癥的早期臨床癥狀不明顯，確診困難[3]。現(xiàn)行的病理學(xué)診斷方法很難檢測早期癌癥的細胞變化，因此，尋找針對早期癌癥方便、快捷、準確率高的診斷方法具有重大意義[4-5]。

拉曼光譜技術(shù)是利用拉曼散射效應(yīng)，對散射光譜進行分析得到分子振動、轉(zhuǎn)動方面的信息，并對物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進行分析識別的技術(shù)[5]。拉曼光譜技術(shù)通過使用一定頻率的激光照射物質(zhì)表面，散射出較低頻率的光線，在利用計算機檢測反射的光線信號來反映分子水平上的生物化學(xué)變化，鑒別各類物質(zhì)[6]。拉曼光譜技術(shù)的這一特性使得它廣泛應(yīng)用于化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)和食品等諸多領(lǐng)域，在醫(yī)學(xué)診斷上的價值也日益重要[7-11]。

人體是由蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子組成，不同的生物大分子都有其特征的拉曼光譜[7]。當組織或細胞發(fā)生癌變時，其內(nèi)部的生物分子均有可能出現(xiàn)變化[8]。這些特征變化一般不會表現(xiàn)為臨床癥狀，在常規(guī)檢查中也難以辨別出來，而拉曼光譜可以檢測出分子水平的微小變化，且具有高精度化、高制動化、無需染色或標記等優(yōu)點，對早期癌癥的診斷具有幫助。經(jīng)過多年拉曼光譜技術(shù)的研究完善，逐步發(fā)展為可以對不同形態(tài)的腫瘤組織、細胞、蛋白質(zhì)、核酸等樣本進行檢測分析，在早期腫瘤診斷中運用越來越廣泛[12]。綜上所述，拉曼光譜技術(shù)可以成為癌癥的病理學(xué)診斷依據(jù)和癌癥早期診斷的途徑之一[5]。

瑞氏-姬姆薩(Wright-Giemsa)染色是一種臨床檢驗工作中常用的染色方法，瑞氏-姬姆薩染液是將瑞氏染液和姬姆薩染液結(jié)合使用，能更好的染色細胞質(zhì)顆粒、細胞核和染色質(zhì)等細胞結(jié)構(gòu)[13]。

本研究運用顯微共聚焦拉曼光譜儀，在532 nm波長激光下檢測了瑞氏-姬姆薩染色的腫瘤細胞和正常細胞，通過統(tǒng)計拉曼特征峰的變化來驗證顯微共聚焦拉曼光譜儀是否能用于區(qū)分經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后的腫瘤細胞與正常細胞。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料及儀器

實驗材料及儀器見表1。

2.2 實驗步驟

實驗步驟如下：

(1)顯微共聚焦拉曼光譜儀進行質(zhì)檢后使用，將激光光斑聚集調(diào)節(jié)至視野正中心；

(2)使用硅片糾正偏差，在50倍物鏡下觀察，收集在532 nm激光波長下500～2 000 cm-1的拉曼光譜信號；

(3)分別檢測經(jīng)處理的淋巴細胞、肝細胞、骨肉瘤細胞、胃癌細胞、肝癌細胞、鼻咽癌細胞和瑞氏吉姆薩染料玻片，對各樣本的拉曼光譜特征峰進行對比；

(4)在每張玻片中隨機選取3個視野，每個視野隨機選取正常細胞和腫瘤細胞各1個，對每個細胞進行3次掃描，取3次掃描結(jié)果的平均拉曼光譜值[14]。

表1 實驗材料及儀器

3 結(jié)果

本研究在用顯微共聚焦拉曼光譜儀532 nm波長激光下檢測經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后的淋巴細胞、肝細胞(見圖1)、骨肉瘤細胞(見圖2)、肝癌細胞(見圖3)、胃癌細胞(見圖4)和鼻咽癌細胞(見圖5)，檢測結(jié)果見表2。

圖1 肝細胞及旁淋巴細胞(×500)Fig.1 Hepatocytes and para-lymphocytes(×500)

圖2 骨肉瘤細胞(×500)

圖3 肝癌細胞(×500) Fig.3 Liver cancer cells(×500)

圖4 胃癌細胞(×500)

圖5 鼻咽癌細胞(×500)

表2 瑞氏-姬姆薩染色樣本拉曼光譜峰位峰強統(tǒng)計表

峰值區(qū)間鼻咽癌肝癌胃癌骨肉瘤肝細胞鼻咽癌旁淋巴肝癌旁淋巴胃癌旁淋巴骨肉瘤旁淋巴染色劑1271 ～12751274 1273 1273 1272 1273 127412731274 12741271407319952500253548001445842463845924741309～13161313 1312131313091312 131313111314 1313130912395916062201536211484143315004181351～13581355 1354 1356 1355 1355 135613521356 1355135622051084134514063117472732263828641421414～14201418 142014161416 1417 14151411417 14171419163942074410362100419520172716637131470～14811473 1474147714741472 147014761472 1473147814295567753951519526388146016563071500～15051504 1504 1503 1504 1504 15031504 1505 15041504 816538814315539310420237527888872882319161620～16241621 1621 1621 1621 1621 16201620 1621 1621 1622 12037500666738842156863030283613136128493084

由于瑞氏-姬姆薩染色較淺，對照組除經(jīng)顯微共聚焦拉曼光譜儀532 nm波長激光下在1 620～1 624 cm-1、1 500～1 505 cm-1、708～713 cm-1、640～643 cm-1四處位置拉曼特征峰顯示峰強較高外，其余特征峰位峰強均顯示較低，見圖6。

注: 由上往下分別為鼻咽癌細胞、肝癌細胞、骨肉瘤細胞、胃癌細胞、肝細胞、淋巴細胞、迪夫染料、瑞氏-姬姆薩染料

圖6 本研究各種細胞的拉曼光譜圖

Fig.6 Raman spectra of experimental cells

4 結(jié)論

本研究利用拉曼光譜技術(shù)測量了經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色的正常細胞和6種腫瘤細胞及瑞氏-姬姆薩染料，拍攝了拉曼光譜激光下各種腫瘤細胞圖像，對比其拉曼信號峰值，發(fā)現(xiàn)各種腫瘤細胞的拉曼光譜峰值和瑞氏-姬姆薩染色料的拉曼信號峰值相同。對光譜進行分析后發(fā)現(xiàn)，檢測到的結(jié)果均為染料的拉曼信號，而6種腫瘤細胞的拉曼信號較弱，無法檢出。由上述結(jié)果分析得出，受瑞氏-姬姆薩染色劑的拉曼信號影響，無法明確檢測出腫瘤細胞的拉曼信號，也無法通過檢測的拉曼信號對正常細胞和腫瘤細胞進行準確的鑒別。

致謝

本次實驗所用顯微共聚焦拉曼光譜儀及其操作方法由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院秦宏偉提供，在此表示真摯的感謝。