董芳芳，苑康見，鄧鳳娟，趙艷，張尚，李正強，孔凡照，趙成如

(1.賽克賽斯生物科技股份有限公司，濟南 250101；2.山東體內植入材料工程技術研究中心，濟南 250101)

1 引 言

醫(yī)療器械浸提的目的是提供適宜的試驗樣品，以測定生物系統(tǒng)中可溶出物的生物學反應，從而驗證可溶出物的潛在危害，用于可溶出物健康風險性評價。當制備器械浸提液時，所用的浸提介質和浸提條件應該既與最終產品的性質和用途相適應，又要與試驗方法的可預見性(如試驗目的、原理、敏感性等)相適應。因此，理想的浸提條件和試驗系統(tǒng)浸提液的應用既要反映產品的實際使用條件，還要反映試驗的目的和預測性[1-5]。

硬腦膜封合醫(yī)用膠是一種用于防止腦脊液滲漏的生物水凝膠產品，用于在神經外科術中對硬腦膜進行輔助機械密封[6-7]。 該產品以粉劑聚乙二醇-N羥基丁二酰亞胺-戊二酸酯(分子量為20 000)與水溶性三賴氨酸/聚乙烯亞胺發(fā)生交聯(lián)反應，噴涂創(chuàng)面后幾秒內迅速聚合形成具有空間立體網狀結構的粘性水凝膠，可快速封合硬腦膜縫合部位，以達到水密封合的效果[8-10]。

本研究以硬腦膜封合醫(yī)用膠為研究對象，選用GB T 14233.1標準推薦的兩種浸提比例，以及ISO10993-12(即GB T 16886.12)中推薦的5種浸提條件下制備浸提液。采用紅外光譜(FTIR)、差示掃描量熱(DSC)、pH值、滲透壓、紫外光譜、液相色譜(HPLC)、電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)進行分析[11-14]。

2 材料與方法

2.1 儀器

pH測定儀，PHS-3D，上海精密科技有限公司；紫外分光光度儀，UV-2450，島津(中國)有限公司；生化培養(yǎng)箱，LRH-150，上海一恒科技有限公司；分析天平，ML204，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；滲透壓儀，OM815，德國羅澤公司；液相色譜儀，Aglient1200，美國安捷倫(中國)公司；電感耦合等離子體質譜儀，6300，美國熱電公司；冷凍干燥機，VFD-2000，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；傅立葉變換紅外-近紅外光譜儀，spectrum400，美國珀金埃爾默；DSC-SP差示掃描量熱分析儀，Rheometric Scientific Inc.；高壓蒸汽滅菌器，LS-B75L，江陰濱江醫(yī)療設備廠。

2.2 藥品與試劑

硬腦膜封合醫(yī)用膠，5 mL/支，賽克賽斯生物科技股份有限公司；氯化鈉注射液，0.9%，山東華魯制藥有限公司；棉籽油，北京百靈威科技有限公司。

2.3 試驗條件

根據(jù)GB T 14233.1∶2008以及ISO10993-12∶2007(即GB T 16886.12∶2005)的推薦，浸提介質為生理鹽水和棉籽油。浸提比例為0.1和0.2 g/mL。浸提條件分別為(37±1)℃，(24±2) h；(37±1)℃，(72±2) h；(50±2)℃，(72±2) h；(70±2)℃，(24±2) h；(121±2)℃，(1±0.1) h。

2.4 凍干樣品的制備

將醫(yī)用膠以及浸提后的醫(yī)用膠放入冷凍干燥機中凍干，在-40℃條件下預凍0.5 h，然后抽真空進行升華，約56 h后收料，得到醫(yī)用膠凍干樣品。

2.5 檢測方法設計

為研究不同浸提條件對硬腦膜封合醫(yī)用膠的浸提影響，我們將凍干樣品和浸提液分別進行不同指標檢測。對凍干樣品進行差示掃描量熱(DSC)、紅外光譜、pH值、滲透壓、紫外光譜指標檢測，對浸提液進行液相色譜、電感耦合等離子體質譜指標檢測，見表1。

表1 檢測信息匯總

3 結果

依據(jù)2.5節(jié)的檢測方法，采用紅外光譜、DSC、pH值、滲透壓、紫外光譜、液相色譜、電感耦合等離子體質譜對硬腦膜封合醫(yī)用膠進行分析，實驗結果見表2。

3.1 差示掃描量熱

DSC掃描過程中，樣品發(fā)生了放熱行為，放熱峰值(TC)均在50℃～60℃之間，見圖1。樣品浸提前后DSC具體結果數(shù)據(jù)見表3。放熱峰值(TC)數(shù)據(jù)略有不同，說明凝膠及浸提后凍干凝膠到達物態(tài)轉變點溫度略有不同，可能與凝膠化學鍵斷裂位置不同引起。縱坐標熱流率變小，分析很可能是溫度高對材料造成改變，樣品中有效成分變少，相對熱流率變小。

表2 實驗結果匯總

圖1 浸提樣品DSC譜圖

表3 不同樣品浸提前后DSC結果

3.2 紅外光譜分析

樣品紅外光譜圖有一定的差異，最為明顯在化學位移1 640～1 660 cm-1處，見圖2。隨浸提溫度升高，吸收峰逐漸變弱，是由于該處為酰胺鍵中羰基-C=0的特征伸縮振動吸收峰，PEI和三賴氨酸中的伯氨或仲氨與NHS活化后的羧基發(fā)生反應形成了酰胺鍵。

圖2 生理鹽水浸提后的凍干凝膠的紅外光譜圖

3.3 生理鹽水pH值

浸提液pH值變化呈下降趨勢， 且pH值變化范圍在7.90～6.40之間，見圖3(a)。引起該結果的原因為，凝膠在浸提液中發(fā)生了降解，降解產物中的PEG呈中性，聚乙烯亞胺(PEI)雖然在水溶液中呈堿性(pH值：10.0～12.0)但含量較少，以酸鹽形式存在的三賴氨酸導致溶液偏酸性，且三賴氨酸的含量大于聚乙烯亞胺，三賴氨酸從凝膠中游離出來后導致浸提液pH值降低。

3.4 生理鹽水滲透壓

0.1與0.2 g/mL的浸提液滲透壓數(shù)值均逐漸升高，且0.2 g/mL的浸提液滲透壓遠高于0.1 g/mL浸提液的，滲透壓變化范圍為275～310 mosm，見圖3(b)。引起該結果的原因可能是凝膠中的三賴氨酸在溶液中以離子形式(NH+、COOH-)存在，使浸提液中離子濃度偏高，導致滲透壓逐漸升高。滲透壓偏高可能會影響部分生物學指標的檢測結果，如皮內反應，溶血率等，由上述數(shù)據(jù)可知，0.1 g/mL的浸提液更適用于生物學評價。

圖3 不同條件下生理鹽水浸提液pH和滲透壓變化趨勢

3.5 紫外光譜分析

三賴氨酸的吸收峰為260 nm，隨著浸提溫度升高，多肽三賴氨酸可能會有一定失活或分解，故吸收峰逐漸減弱，見圖4(a)。失活或分解的三賴氨酸仍含有酸鹽，故與3.3生理鹽水pH值檢測結果不矛盾。

在630 nm處有微弱吸收峰，此處為N-羥基丁二酰亞胺的吸收峰。由于N-羥基丁二酰亞胺溶于溶液中會很快開環(huán)，不受浸提溫度的影響隨溫度變化，故該吸收峰變化不大。

在棉籽油浸提液中有一定吸光度的雜峰，但不同溫度和浸提比例，吸收變化差異不大，說明浸提液內為棉籽油自身物質，而凝膠中大部分為水溶性物質，故未從棉籽油中浸提出，見圖4(b)。

圖4 生理鹽水浸提液和棉籽油浸提液的紫外光譜圖

圖5 生理鹽水浸提液的液相色譜圖

3.6 液相色譜分析

2.8 min處為PEG的峰，2.2 min處為雜質峰，隨著浸提溫度升高，樣品峰面積變化不大，而2.2 min的雜質峰面積略有增加。說明PEG中的-CH2-CH2-結構較為穩(wěn)定，溫度較高也未引起含量的降低。2.2 min處的雜質峰可能由凝膠中物質或浸提液高溫引起，見圖5。

3.7 電感耦合等離子體質譜分析

不同浸提溫度和浸提比例，以生理鹽水或棉籽油作為浸提液，浸提液中重金屬總含量均無明顯差異，僅比空白液略高。說明由材料中溶出的重金屬含量不高，見圖6。

圖6 不同條件浸提液重金屬含量

4 結論

本研究通過不同浸提條件對硬腦膜封合醫(yī)用膠產品進行浸提，并對其理化指標進行分析，通過紅外光譜、差示掃描量熱、液相色譜、電感耦合等離子體質譜等檢測，結果顯示不具有等效性，隨著浸提溫度的升高，材料降解情況明顯，尤其是紫外檢測顯示(121±2)℃，(1±0.1) h下三賴氨酸吸收峰幾乎消失，對產品影響較大。參考GB T16886.12的附錄C.5“浸提不應使材料發(fā)生明顯降解”的要求，本產品的浸提條件應該選擇較低的溫度，因此，優(yōu)選浸提溫度為(37±1)℃。

在(37±1)℃條件下，由實驗數(shù)據(jù)可知，(24±2) h和(72±2) h兩個浸提時間下，各項數(shù)據(jù)差異不大。但參考GB T 16886.12的附錄C.5 “植入器械如僅在鹽水中(37±1) ℃浸提(24±2)h是很難被接受的”，最終優(yōu)選浸提時間為(72±2) h。由于本研究于2017年初設計，參考標準為GB T 16886.12-2005推薦的5個浸提條件，GB T 16886.12-2017執(zhí)行后將浸提條件改為4個，刪除浸提條件(37±1)℃，(24±2)h，也說明該條件的不適宜性。

由于滲透壓檢測指標顯示0.2 g/mL浸提造成離子濃度大，滲透壓偏高，因此，本研究浸提比例選擇0.1 g/mL。綜上，本研究硬腦膜封合醫(yī)用膠浸提液的制備條件為0.1 g/mL， (37±1)℃，(72±2) h。