馬 藝 萌， 叢 麗 娜， 胡 雅 莉， 謝 定 剛

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

枯草芽孢桿菌作為有效益生菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)大多為低分子抗菌脂肽[1]。其獨特的化學(xué)組成和兩親性的小分子肽結(jié)構(gòu)，因此具有低抗藥性、低毒、抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性高、生物可降解等優(yōu)點，是一類綠色、安全、高效的抗生素替代品，又稱為脂肽類抗生素[2]。近年來，從海洋微生物中不斷發(fā)現(xiàn)具有生理意義的新次級代謝產(chǎn)物[3]，這類物質(zhì)通常具有陸地微生物所沒有的獨特結(jié)構(gòu)，在抗病菌、抗腫瘤、抗病毒等方面具有良好表現(xiàn)[4]。

黃曲霉(Aspergillusflavus)屬于曲霉屬真菌，在自然界分布很廣，常存在于土壤和其他物質(zhì)中[5]，依靠產(chǎn)生的分生孢子和菌核在作物中交叉感染，侵染糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料等，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，威脅人類和畜禽健康[6]。黃曲霉毒素是由黃曲霉產(chǎn)生的，具有很強的毒性，被認(rèn)為有致癌性、致突變、致畸性、抑制免疫力等作用，并可引起肝部損傷等危害[7]。因此黃曲霉的生物防治成為國內(nèi)外研究的熱點。

目前利用用物理、化學(xué)方法防止黃曲霉的生長及清除毒素的研究比較多，但效果并不理想且成本較高[8]。本實驗通過對枯草芽孢桿菌進行抗真菌物質(zhì)的提取純化[9]，并對純化后的活性物質(zhì)進行擴大培養(yǎng)，最終應(yīng)用于抗黃曲霉實驗[10]。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗菌株

供誘變篩選的實驗菌株為枯草芽孢桿菌HS-301，由本實驗室分離篩選并保藏。

供試指示菌為金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和黃曲霉菌(Aspergillusflavus)，本實驗室購買并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：0.5%酵母浸粉，1%胰蛋白胨，1% NaCl，pH 7.2～7.4。固體培養(yǎng)基需另加1.8%瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：1%葡萄糖，1.5%牛肉膏，0.5%磷酸氫二鉀，pH 7.0。

黃曲霉(Czapek’s)培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L；NaNO33g/L；MgSO4·7H2O 3 g/L；KCl 3 g/L；FeSO4·4H2O 3 g/L；K2HPO43 g/L；瓊脂 15 g/L；蒸餾水1 L；pH 6.0～6.5。

1.2 方 法

1.2.1 誘變菌株的篩選

將枯草芽孢桿菌HS-301進行活化培養(yǎng)并制備108CFU/mL菌懸液，用紫外照射10 s對菌液進行誘變。將菌液涂布培養(yǎng)，挑取形態(tài)特征不同的單菌落分離并進行試管發(fā)酵培養(yǎng)。通過牛津杯法對誘變菌株進行初篩和復(fù)篩。利用黃曲霉真菌作為指示菌進行進一步篩選，篩選出一株對黃曲霉菌抑制效果最為顯著的誘變菌株，命名為mutHS-407，并對其進行傳代培養(yǎng)和穩(wěn)定性檢測。

1.2.2 抗菌活性提取物的制備及分子量確定

采用酸沉淀分離法，將菌株mutHS-407的發(fā)酵上清液pH調(diào)至2，得到白色沉淀，放置4 ℃過夜。次日將所得沉淀用甲醇溶解過濾后進行真空抽提，得到含有抗菌活性物質(zhì)的提取物干品。通過Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測該提取物中的活性物質(zhì)的分子質(zhì)量。

1.2.3 抗菌活性測定

采用濾紙片法對菌株mutHS-407產(chǎn)物的提取物進行抑菌活性測定。提取物用甲醇充分溶解后作為樣品組，無添加的甲醇作為對照組，將黃曲霉菌培養(yǎng)液均勻涂布于Czapek’s固體培養(yǎng)基上，待平板干透向濾紙片中加樣。分別將實驗組及對照組進行3次平行實驗，觀察并比較抑菌圈大小。

1.2.4 抗菌活性粗提物的組分分離

采用30 mm×300 mm硅膠柱對提取物進行單組分分離。將2 g提取物干品進行上樣后，通過氯仿-甲醇混合液梯度洗脫，按照每個梯度洗脫一個柱體積的方式逐級洗脫。對收集到的每管洗脫液進行黃曲霉菌抗菌效果檢測。將對黃曲霉菌有抑菌作用的洗脫液合并蒸干，命名為OP-1。

采用Amberlite XAD l600型大孔吸附樹脂(20 g)對蒸干后的組分進一步分離純化[11]。用甲醇和水分別沖洗樹脂一個柱體積后進行梯度洗脫，分管收集。對洗脫液進行抑菌活性分析，合并具有抑霉菌活性的洗脫液后再次蒸干，即獲得純度較高的抗菌活性化合物，命名為OP-2。

1.2.5 高效液相色譜及質(zhì)譜分析活性物質(zhì)

采用Unitary C18柱，進行流動相為乙腈和超純水的梯度洗脫。收集純化后的單組峰團并濃縮，作為下一步質(zhì)譜鑒定的樣品。進一步應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)及DataExplorer軟件準(zhǔn)確分析其分子質(zhì)量[12]。

1.2.6 抗菌活性提取物在花生防霉中的應(yīng)用

稱取不同濃度的由菌株mutHS-407發(fā)酵液所產(chǎn)的抗菌提取物，用無菌蒸餾水溶解。每100 mL 三角瓶中加入相同質(zhì)量滅菌后的花生，并加入10 mL各濃度的抗菌提取物，充分混勻后接入相同濃度黃曲霉孢子懸浮液，放入培養(yǎng)箱后觀察并記錄花生上黃曲霉菌的生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌粗提物的制備及抑菌活性分析

利用枯草芽孢桿菌HS-301原始菌進行紫外化學(xué)復(fù)合誘變，采用牛津杯法進行初篩，得到了5株對常見食物細(xì)菌有明顯抗菌作用的誘變菌株，如表1所示。為了獲得對真菌也具有強烈抗菌作用的菌株，接著對篩選出的5株誘變菌進行二次篩選，由于在已知的真菌毒素中，黃曲霉毒素的毒性較大且致癌性最強，因此復(fù)篩以黃曲霉菌作為主要指示菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘變菌株mutHS-407比原始菌HS-301對于黃曲霉菌的抑制作用有顯著增加。并對其進行傳代培養(yǎng)，結(jié)果如表2所示。可以看出該誘變菌株性質(zhì)穩(wěn)定，可長久保存。

表1 誘變菌和原始菌的抑菌活性比較Tab.1 Comparison of antibacterial activities between mutagenic and original strains

表2 誘變菌和原始菌的抗霉菌活性比較Tab.2 Comparison of antibacterial activities between mutagenic and original strains

由圖1可以看出，原始菌株所形成的透明抑菌圈在培養(yǎng)4 d后被黃曲霉菌絲完全覆蓋，而誘變菌株mutHS-407的透明圈依舊清晰，由此可見該誘變菌株中的活性物質(zhì)對黃曲霉菌具有很強的抑制作用，且性質(zhì)穩(wěn)定。因此篩選得到的菌株mutHS-407對常見食用細(xì)菌和真菌均具有比原始菌株更強的抗菌效果，其中對霉菌的抑制作用效果更加明顯。

(a) HS-301

(b) mutHS-407圖1 誘變菌和原始菌對黃曲霉菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of A. flavus by mutagenic and original strains

2.2 活性物粗提及分子質(zhì)量測定

對誘變菌株mutHS-407進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過酸沉和有機試劑抽提法對該發(fā)酵液進行抗菌活性物質(zhì)的提取，得到抗菌活性提取物OP，呈黃棕色粉末狀。對該提取物干品質(zhì)量及原始菌體濕重進行稱量，菌體濕重為38.956 g/L，產(chǎn)率為2.305 g/L。

如圖2所示，Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測到OP中的活性物質(zhì)分子質(zhì)量在3.3 ku以下，即提取物中包含的是小分子質(zhì)量活性物質(zhì)。

M，標(biāo)準(zhǔn)Marker； OP，抗菌提取物圖2 Tricine-SDS-PAGE電泳分析圖Fig.2 Result of Tricine-SDS-PAGE electrophoresis analysis

2.3 組分活性檢測及液相色譜和質(zhì)譜分析

如圖3所示，粗提物OP經(jīng)TLC板分析并經(jīng)254 nm紫外光顯色后，分離出4種活性成分，通過抑菌實驗證明了其中a和b兩種活性成分對4株細(xì)菌具有一定的抑制作用，而對真菌無作用；成分d僅對兩株革蘭氏陰性的海洋致病菌有抑制作用；只有成分c對真菌黃曲霉菌有明顯抑制作用，同時對4種細(xì)菌也具有抑菌活性。

圖3 粗提物的TLC分析Fig.3 TLC results of the crude extracts

對抗菌提取物及其分離純化組分進行高效液相色譜分析，如圖4所示。圖4(a)為從誘變菌株mutHS-407中提取出的抗菌提取物OP，圖中可觀察到有許多活性物質(zhì)峰，其中包含了圖3中的4種活性成分，主要的兩組活性峰團的出峰時間在16～18 min和22～25 min。圖4(b)是經(jīng)硅膠柱層析對提取物OP進行分離得到的活性組分OP-1，由峰圖可見，在去掉一組主要的峰團后，其出峰時間主要集中在16～18 min；并且經(jīng)抑菌活性分析，該組峰團對黃曲霉菌具有明顯抑制作用。由于純度尚未達(dá)到目標(biāo)，將組分OP-1經(jīng)大孔吸附樹脂進一步分離純化，從圖4(c)中可以看出，此次分離得到了一個單一的活性組分(質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)92.42%)。經(jīng)TLC分析OP-1和OP-2發(fā)現(xiàn)，兩組組分中主要包含的是圖3中的活性成分c，并在過柱純化過程中將a、b、d 3種成分去除。

圖4 抗菌提取物及其純化組分HPLC分析Fig.4 HPLC results of antibacterial crude extracts and its purified components

經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，與數(shù)據(jù)比對后證明在最初提取物OP中，a和b的主要活性物質(zhì)為溶桿菌素(Bacilysin)和芬薺素(Fengycin)的混合物；c的主要活性物質(zhì)為桿菌霉素D(BacillomycinD)；d的主要活性物質(zhì)為伊枯草菌素(Iturin)。因此能夠證明，該實驗最終得到的純化組分OP-2中的活性物質(zhì)主要為成分c中的脂肽類化合物桿菌霉素D。

將3個活性組分物質(zhì)OP、OP-1和OP-2進行黃曲霉菌的抑菌實驗，結(jié)果如5所示。在相同質(zhì)量濃度(10 mg/mL)下，純化組分OP-2的抑菌活性均高于OP和OP-1。表明枯草芽孢桿菌誘變株mutHS-407所產(chǎn)生的桿菌霉素D對黃曲霉菌有很強的抑制作用。

(a) OP

(b) OP-1

(c) OP-2圖5 活性組分對黃曲霉菌的抑制作用Fig.5 Inhibition of A. flavus by antibacterial components

2.4 抗菌提取物在花生中的最佳質(zhì)量濃度及驗證

將加入了不同質(zhì)量濃度抗菌提取物的花生和對照組，放入培養(yǎng)箱中溫育6 d，取出觀察并計算每組花生的發(fā)霉數(shù)量，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)抗菌提取物質(zhì)量濃度為40 mg/mL時，可完全抑制花生中黃曲霉菌的生長，所以選擇提取物質(zhì)量濃度為40 mg/mL。

圖6 不同質(zhì)量濃度提取物對花生霉變的影響Fig.6 Effects of different concentrations of extracts on peanut mildew

檢驗40 mg/mL提取物的抗菌效果，如圖7所示。在相同條件下培養(yǎng)10 d后，對照組能明顯看出所有花生均發(fā)霉且長出濃密的黑色孢子及菌絲，而添加40 mg/mL提取物僅有少數(shù)花生發(fā)芽卻未長黃曲霉菌。可以推斷該抗菌提取物可有效地防止花生及其他糧食的霉變。

(a) 添加40 mg/mL抗菌提取物

向枯草芽孢桿菌誘變菌mutHS-407的菌株發(fā)酵液中加入5%的玉米淀粉，攪拌均勻并進行真空噴霧干燥，按照與市面常見防霉劑相同的加工工藝，制備成抗菌肽干粉。如表4所示，將該產(chǎn)品與市面上5種常見脫霉劑進行花生的抗霉菌實驗對比，向含有相同質(zhì)量濃度黃曲霉菌懸浮液的等量花生中，分別添加表4中的6種脫霉產(chǎn)品，觀察并計算最低抑菌濃度。結(jié)果表明，在相同質(zhì)量濃度條件下，除了添加了化學(xué)成分的脫霉劑，通過本實驗篩選得到的誘變菌株mutHS-407的抑菌效果比市面上其他生物防霉劑的抑菌效果更明顯，抑菌作用更強。

表4 脫霉產(chǎn)品名稱及主要成分Tab.4 The main components of mould free products

3 討 論

通過對枯草芽孢桿菌HS-301進行紫外化學(xué)復(fù)合誘變，篩選出一株對黃曲霉菌有強烈抑制作用的高產(chǎn)抗菌肽誘變穩(wěn)定菌株mutHS-407，通過對其中抗真菌活性物質(zhì)的提取，得到抗菌脂肽提取物。利用硅膠柱層析和大孔吸附樹脂兩步純化，得到單一活性組分，通過高效液相色譜和質(zhì)譜分析和鑒定該組分，發(fā)現(xiàn)其中主要物質(zhì)為桿菌霉素D，且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)90%以上。將該抗菌活性提取物應(yīng)用于花生的抗霉菌實驗中，發(fā)現(xiàn)其抗霉菌效果顯著。得到的抗菌提取物有望開發(fā)并作為新型生物防霉劑，并應(yīng)用到食品及飼料工業(yè)中。