張 凌，佟盼盼，張 毅，馬曉玉，張萌萌，劉璐瑤，姚 剛，陳童錦悅，蘇戰(zhàn)強(qiáng)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)通常被認(rèn)為是一種多種動(dòng)物都攜帶的腸道共生菌，但是某些大腸桿菌會導(dǎo)致動(dòng)物和人類發(fā)病和死亡[1]。其中，產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli，STEC)引發(fā)的人類疾病最為嚴(yán)重。新疆作為主要羊肉銷量地區(qū)之一，關(guān)注新疆羊源STEC的攜帶能力和致病潛力是必要的?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】全世界每年STEC導(dǎo)致3 890例溶血性尿毒癥(Hemolyticuremicsyndrome，HUS)，270例終末期腎病，230例死亡，用于治療的直接和間接費(fèi)用超過10億美元[2]。我國曾在蘇皖地區(qū)發(fā)生過一次STEC爆發(fā)[3]，牛被認(rèn)為是STEC最主要的宿主，而且相關(guān)的研究也較多[4]。研究表明，牛之外的許多動(dòng)物也常常攜帶并不斷排出STEC，最常見的STEC排菌量較多的動(dòng)物是綿羊、山羊[5]，當(dāng)然，豬、貓、犬，及野生動(dòng)物海鷗和鹿等都有攜帶STEC的報(bào)道[6, 7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我國關(guān)于羊源STEC的攜帶情況鮮有報(bào)道，只有極少數(shù)地區(qū)曾經(jīng)報(bào)道從羊糞便中分離到了STEC，而對于羊源STEC菌株毒力基因亞型及耐藥性的研究幾乎沒有。2010年到2014年，新疆人的羊肉消費(fèi)量約占全國消費(fèi)量的40%[8]。研究新疆羊源STEC的耐藥性和毒力情況，評價(jià)羊源STEC在羊產(chǎn)業(yè)鏈飼養(yǎng)階段的風(fēng)險(xiǎn)。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究采集新疆阿克蘇地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場的2月齡羔羊肛拭子，進(jìn)行羊源STEC的分離鑒定，對羊源STEC的耐藥性和毒力基因做了研究，為羊源STEC的致病潛力提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集及處理

2018年10月，于新疆阿克蘇地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場，用生理鹽水浸潤的無菌棉棒隨機(jī)采集2個(gè)月左右健康杜泊羔羊的肛拭子21份，放入3 mL的EC肉湯液體培養(yǎng)基中，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室。之后，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，再進(jìn)行STEC和E.coliO157：H7的分離鑒定。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

EC肉湯、麥康凱培養(yǎng)基(MAC)，山梨醇麥康凱培養(yǎng)基(SMAC)均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR 反應(yīng)相關(guān)試劑(2×Taq PCR Green Mix、ddH2O)，購自新疆寶信生物工程有限公司。

空氣浴振蕩恒溫培養(yǎng)箱(型號 MOD-EL：ST-F160AC)；SW-CJ-2F 雙人雙面垂直潔凈工作臺(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；Eppendorf Mastercycler nexus GSX1 PCR 儀；DYY-7C 型電泳儀(北京市六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)TRANSILLUMINATOR JVLABO；高溫高壓滅菌鍋(型號 HVE-50)。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)合成

列出引物序列信息，引物均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成。表1

表1 引物序列

1.2 方 法

1.2.1 STEC的分離鑒定

菌液PCR：用上述1.1.1的EC肉湯培養(yǎng)液做菌液雙重PCR(stx1與stx2)，體系為2×TaqPCR MasterMix 7μL，上下游引物各使用0.5 μL，菌液1 μL，將ddH2O補(bǔ)至12.5 μL。引物參照表1。PCR運(yùn)行程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性 30 s，59℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。表1

菌落PCR：將菌液PCR檢測出有陽性條帶的培養(yǎng)液接種于MAC平板上，37℃培養(yǎng)12 h，挑選出5個(gè)粉紅色的單菌落，取其1/2做菌落雙重PCR，將有陽性條帶菌落的另外1/2純化保存。

1.2.2E.coliO157:H7的分離鑒定

使用上述1.1.1的EC肉湯培養(yǎng)液接種于SMAC平板上，37℃過夜培養(yǎng)，次日挑選出具有白色菌落樣品的平板，從每個(gè)平板中挑選出5個(gè)無色的單菌落，接種于MUG培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，時(shí)間控制在12 h。次日在陰暗無光處使用紫外分析儀，挑選出無熒光的菌液，取一波爾環(huán)菌液再次接種于SMAC瓊脂平板上，從中選取5個(gè)無色單菌落的一半做菌落雙重PCR進(jìn)行初次驗(yàn)證，引物(rfbE與fliC)參見表1。體系為2×TaqPCR MasterMix 7 μL，上下游引物各使用0.5 μL，菌液1 μL，將ddH2O補(bǔ)至12.5μl。PCR運(yùn)行參數(shù)：94℃預(yù)變性3min，94℃變性 30 s，61℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。將出現(xiàn)陽性條帶的另一半菌落純化保存。表1

1.2.3E.coliO157：H7是否STEC檢測

將分離株E.coliO157：H7做菌液雙重PCR，檢測是否含有stx1和/或stx2基因，判斷是否屬于STEC。

1.2.4 耐藥性檢測

1.2.4.1 菌株來源

受試菌株：分離到的10株STEC，E.coliATCC25922保存于實(shí)驗(yàn)室。

1.2.4.2 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)臨床用藥情況選定18種抗菌藥物采用紙片擴(kuò)散法測定菌株的耐藥性。包括氨芐西林(Amp)，阿莫西林/克拉維酸(A/C)，頭孢噻肟(CTX)，頭孢他啶(CAZ)，頭孢吡肟(FEP)，哌拉西林-他唑巴坦(TZP)，氨曲南(AZM)，慶大霉素(CN)，氨芐西林-舒巴坦(SAM)，阿米卡星(AN)，左氧氟沙星(LEV)，環(huán)丙沙星(CIP)，四環(huán)素(TE)，磺胺甲基異惡唑(SXT)，氯霉素(CHL)，多粘菌素(PB)，鏈霉素(S)，哌拉西林(PIP)。用電子游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑，根據(jù)“革蘭氏陰性桿菌藥敏試紙盒”使用說明書提供的參考值判定結(jié)果。

1.2.4.3 耐藥基因檢測

通過PCR的方法檢測TEM，CTX，SHV3種耐藥基因。引物參照表1，使用2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各使用0.5 μL，菌液1 μL，將ddH2O補(bǔ)至25 μL。SHV和TEM基因的PCR運(yùn)行參數(shù)：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸 45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。CTX基因PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，50℃退火30 min，72℃延伸45 s，33個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 毒力基因與血清型檢測

對10株分離菌進(jìn)行隔夜培養(yǎng)，用煮沸法提取DNA。使用PCR方法檢測分離株DNA提取液中ehxA，hlyA，eae，stx1a，stx1c，stx1d，stx2a，stx2b，stx2c，stx2d，stx2e，stx2f，stx2g毒力基因，9株STEC檢測了O121，O45，O145，O103，O111，O26，O157血清型情況。參照表2的引物參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用25 μL體系，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各使用0.5 μL，DNA模版1 μL。擴(kuò)增后使用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

表2 引物序列

1.2.6 綿羊血平板溶血性檢測

使用具有溶血素ehxA與hlyA的菌，在5%的綿羊鮮血瓊脂平板上接種劃線，37℃過夜培養(yǎng)，觀察溶血環(huán)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 STEC的分離鑒定

研究表明，通過對該養(yǎng)殖場的21份羔羊肛拭子的檢測，其中9份樣品中檢測出了STEC(stx1)，檢測率為42.86%。通過山梨醇發(fā)酵與MUG試驗(yàn)結(jié)合雙重PCR的方式，分離到1株E.coliO157：H7，經(jīng)檢測此株菌也屬于STEC(stx1)。圖1，圖2

注：M.DL2000 marker；“-”.陰性對照；“+”.陽性對照(O157：H7標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC 21530)；1～9.STEC 菌株P(guān)CR擴(kuò)增圖譜；10.E.coli O157：H7株驗(yàn)證為STEC

注：M.DL2000；“-”.陰性對照；“+”.陽性對照(O157：H7標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC 21530)；10.E.coli O157:H7 PCR擴(kuò)增圖譜

2.2 耐藥情況

研究表明，有2株STEC對頭孢吡肟具有耐藥性，耐藥率為20%。1株STEC對頭孢噻肟表現(xiàn)中度敏感，2株STEC對頭孢吡肟表現(xiàn)中度敏感，4株STEC對多粘菌素表現(xiàn)中度敏感。使用β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢測10株菌的攜帶情況，沒有發(fā)現(xiàn)有相關(guān)耐藥基因。圖3

注：S.敏感；I.中介；R.耐藥

2.3 毒力基因及其亞型的攜帶情況

研究表明，除1株E.coliO157：H7以外，其他的9株STEC均不屬于O121，O45，O145，O26，O103，O111和O157。10株菌均有stx1基因。其中1株非O157 STEC與O157：H7 STEC菌株攜帶stx1，ehxA，hlyA3種毒力基因，并且毒力基因亞型均為stx1c。攜帶了stx1型的菌株60%含有stx1a，70%含有stx1c，40%攜帶stx1a+stx1c，并沒有攜帶stx1d的菌株。毒力基因分布情況見圖6，PCR擴(kuò)增圖譜見圖4和圖5。使用兩株具有ehxA與hlyA的菌液在5%綿羊血平板上并未呈現(xiàn)出溶血環(huán)。圖4～6

注：M.DL2000；“-”.陰性對照；A：1～10.hlyA基因PCR擴(kuò)增圖譜，B：1～10.ehxA基因PCR擴(kuò)增圖譜

注：M.DL2000；“-”.陰性對照；A：1～10.stx1a 基因PCR擴(kuò)增圖譜；B：1～10.stx1c 基因PCR擴(kuò)增圖譜

圖6 毒力基因分布情況

3 討 論

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌是一類危害嚴(yán)重的人畜共患病原菌[16]。近年來，由非 O157 STEC引起的食物中毒事件持續(xù)增長，因此檢測致病性大腸桿菌STEC非常重要[5]。羊作為新疆畜牧業(yè)發(fā)展的優(yōu)勢群體，羊肉在新疆的肉源食品中占有重要地位。關(guān)注羊源STEC的流行狀況至關(guān)重要。國外有許多關(guān)于羊源STEC的報(bào)道。在西班牙，羊源STEC O157:H7菌株與非O157 STEC菌株的分離率為1.0%與35.0%，也不乏有一些高分離率達(dá)到8.7%與50.8%[17]。在德國，從抽樣動(dòng)物中分離出28.9%的STEC菌株，其中最常見的是綿羊和山羊[2]。巴西南部羊群中有50%被分離出STEC[18]。國內(nèi)胡彬等于2017年與2018年分別在山東某地區(qū)報(bào)道過兩次羊的糞便中檢測到STEC，分離率為0.8%與0.0%[19, 20]。江蘇某地健康羊糞便分離率為19.4%[21]。而新疆有關(guān)羊源STEC的報(bào)道并不清楚。研究檢測了新疆阿克蘇地區(qū)某羊養(yǎng)殖場中STEC的攜帶情況，結(jié)果顯示該地區(qū)羊源STEC分離率達(dá)到(9/21)42.86%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于我國已報(bào)道地區(qū)的分離率。

志賀毒素是STEC主要的致病物質(zhì)，對細(xì)胞具有凋亡作用。志賀毒素分為兩類，即志賀毒素1(stx1)和志賀毒素2(stx2)，分別由stx1和stx2基因編碼[22]。志賀毒素還進(jìn)一步分為不同的亞型，包括stx1a，stx1c，stx1d，stx2a，stx2b，stx2c，stx2d，stx2e，stx2f，stx2g。不同的志賀毒素型，對人的致病性也有所差異。單獨(dú)攜帶stx1的菌株主要引起人的腹瀉，罕見引起HUS，而Stx2最易引起HUS[23]。stx2a亞型與人類溶血性腸炎(HC)等疾病密切相關(guān)。STEC的毒力表達(dá)還與內(nèi)膜蛋白eae，腸溶血素ehxA和hlyA基因相關(guān)，許多作者強(qiáng)調(diào)攜帶eae基因的STEC菌株能引起嚴(yán)重人類疾病，特別是與HUS相關(guān)的一些疾病。這種重要的毒力基因在綿羊中只存在很小的比例，但是，內(nèi)膜的產(chǎn)生與發(fā)病機(jī)制并沒有直接性關(guān)系。缺乏eae基因的菌株仍然在美國和澳大利亞產(chǎn)生過3例與HUS有關(guān)的病例[24]。ehxA與hlyA基因一般出現(xiàn)在腸出血性大腸桿菌(EHEC)中，EHEC可產(chǎn)生較大毒力，引起人類的血性腹瀉[25]。此次研究的10株菌中均檢測到了stx1，與山東地區(qū)報(bào)道的羊源非O157 STEC均為stx2不吻合[20]。毒力基因亞型的組合有40%為stx1a+stx1c組合，這與伊朗地區(qū)小牛和山羊及美國的櫻桃西紅柿攜帶的亞型組合有相同之處[26, 27]，毒力基因亞型與相關(guān)國外羊源毒力基因亞型報(bào)道沒有較大差異，都以stx1c為主[28, 29]。此次研究中的菌株未攜帶eae基因，但是有攜帶ehxA與hlyA基因的菌株。羊源STEC對人的致病風(fēng)險(xiǎn)需要進(jìn)一步探究。

STEC在不同的地理環(huán)境中存在的主要血清型是有所差異的。在巴西地區(qū)某羊群中以血清型O76與O65為主，并未發(fā)現(xiàn)血清型O157[18]。在澳大利亞，非O157 STEC菌株最常見的血清型是O111與O26，在歐盟，O157，O26，O111，O103和O145是最主要的血清型[2]。在伊朗，主要致病性血清型為O157和非O157 STEC中的O103和O128[30]。目前歐美等國主要檢測以O(shè)121為代表的血清型“Top Six”[5]。我國對STEC的血清型檢測以“Top Six”與O157為主。此次研究的10株菌中，除一株E.coliO157：H7，另外9株菌血清型不屬于“Top Six”和O157。羊源STEC中還具有許多血清型與人類的一些疾病密切相關(guān)，在已知的 101 種血清型中，23 種是從患有 HUS 的病人中分離到的[21]。所以新疆地區(qū)羊源的優(yōu)勢血清型需要進(jìn)一步的研究。

養(yǎng)殖業(yè)對抗生素的不規(guī)范使用，會給動(dòng)物腸道內(nèi)的菌株帶來一定的耐藥選擇性壓力[20]。國外的相關(guān)報(bào)道顯示，綿羊中STEC對鏈霉素、阿莫西林-克拉維酸和納利地克酸的耐藥率較高。Ghanbarpour等[31]發(fā)現(xiàn)綿羊中對青霉素的耐藥率較高。在我國，山東省某地區(qū)關(guān)于羊源STEC耐藥性研究結(jié)果表明，對磺胺異唑，復(fù)方磺胺異唑和萘啶酸，四環(huán)素和氯霉素等存在多重耐藥現(xiàn)象[19, 20]。研究對10株STEC檢測了18種常用抗生素的藥敏反應(yīng)，有2株菌對頭孢吡肟耐藥，其耐藥率為20%，沒有發(fā)現(xiàn)其他耐藥性菌株。針對藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對10株菌還做了β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢測，尚未發(fā)現(xiàn)有耐藥基因的存在。這說明新疆羊源STEC對目前的抗菌素普遍敏感，反映出新疆羊群良好的養(yǎng)殖環(huán)境和較少的抗生素使用。

4 結(jié) 論

新疆阿克蘇地區(qū)某羊養(yǎng)殖場STEC的攜帶率(42.86%)較高，攜帶血清型“TOP 7”中O157 STEC分離株；10號O157 STEC與2號非O157 STEC出現(xiàn)在同一樣品中；菌株中攜帶常見毒力基因ehxA(20%)和hlyA(20%)，毒力基因亞型以stx1c(70%)為主，毒力基因亞型以stx1a+stx1c(40%)為主；菌株對藥物敏感性高，僅有20%的菌株對頭孢吡肟耐藥，且未發(fā)現(xiàn)耐藥基因的存在。結(jié)合此結(jié)果，羊源STEC具有較弱的潛在致病力，但是O157：H7與非O157 STEC出現(xiàn)在同一病原體上。