李雪松 王立平 譚佳音

【摘 要】目的：研究緊密連接蛋白Claudin6在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義。方法：收集2018年8月到2019年7月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理診斷中心標(biāo)本，其中乳腺癌組織78例和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織44例，采用免疫組化法檢測(cè)乳腺癌組織中Claudin6的表達(dá)情況。結(jié)果：乳腺癌中Claudin6陽性表達(dá)率低于癌旁正常組織，Claudin6在乳腺癌中的表達(dá)（66.67%）與癌旁正常組織的表達(dá)（88.64%）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：為后續(xù)研究Claudin6在乳腺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用奠定基礎(chǔ)，也為臨床治療提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌，Claudin6，免疫組化法

【中圖分類號(hào)】R737.9 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B ? ?【文章編號(hào)】1002-8714（2020）07-0047-01

乳腺癌是影響我國女性健康的最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌的發(fā)病率居于我國女性癌癥發(fā)病率第一位[1]。緊密連接蛋白Claudins是緊密連接復(fù)合物的主要構(gòu)成成分，參與維持緊密連接的選擇性滲透和細(xì)胞極化[2]。有研究顯示，Claudins蛋白可能在多種腫瘤的發(fā)生，浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3]。到目前為止，已有 27種 Claudins 蛋白家族成員在人體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，其序列的一致性為12.5%～69. 7%，大部分相對(duì)分子質(zhì)量為20000～27000，目前已有 21 種被鑒定在人類身體中存在[4]。Claudin6是Claudins蛋白家族的 27 個(gè)成員之一。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化的方法分析Claudin6在乳腺癌組織中的表達(dá)為后續(xù)研究Claudin6 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能起到的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料來源：收集2018年8月到2019年7月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理診斷中心標(biāo)本，其中乳腺癌組織78例和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織44例患者術(shù)前均未經(jīng)任何抗癌治療。乳腺癌組織標(biāo)本均為女性，患者年齡最大78歲，最小22 歲，平均年齡為47.8 歲。乳腺癌標(biāo)本及癌旁正常組織用10%中性緩沖福爾馬林液常溫固定后脫水包埋，制成蠟塊。

1.2主要儀器和試劑：光學(xué)顯微鏡，電熱恒溫培養(yǎng)箱，Claudin6羊抗人多克隆抗體，SP免疫組化試劑盒。

1.3免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)SP法對(duì)78 例乳腺癌組織和 44例癌旁正常組織的Claudin6進(jìn)行了檢測(cè)。固定包埋乳腺癌組織標(biāo)本，以 2-3?m 厚切片，脫蠟水化;抗原修復(fù);滴加 3% H2O2，室溫孵育 15min，PBS沖洗，5min×3 次;滴加即用型正常山羊血清，室溫孵育 30min，滴加 0.01M PBS 稀釋的一抗（1：100 PBS 稀釋羊抗人 Claudin6 多克隆抗體），4°C冰箱過夜。PBS 沖洗，5 min×3 次;滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育 20 min。PBS 沖洗，5 min×3 次;滴加鏈霉素親生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育 20 min，PBS 沖洗，5 min×3 次;滴加新鮮配制的 DAB 顯色劑，顯微鏡下觀察顯色;自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS 代替一抗做陰性對(duì)照。

1.4免疫組化結(jié)果判定 Claudin6表達(dá)在細(xì)胞胞膜或者胞漿中， 呈棕黃色或者棕褐色均勻或者有顆粒狀染色。觀察陽性細(xì)胞的數(shù)量與分布， 在20×10倍顯微鏡下任意選取5個(gè)視野， 計(jì)算出平均每個(gè)視野中陽性細(xì)胞百分率， 陽性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性， 陽性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)資料應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理， P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

78例乳腺癌組織中52例Claudin6表達(dá)陽性，陽性率為66.67%（52∕78）。44例癌旁正常組織中39例Claudin6陽性表達(dá)，陽性率為88.64%（39∕44）。Claudin6 在乳腺癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織，棕褐色顆粒定位于乳腺癌細(xì)胞及癌旁正常細(xì)胞的細(xì)胞膜或者細(xì)胞漿中，但兩者比較差異無顯著性（P>0.05）。

3 討論

Claudin6 在乳腺癌組織中的表達(dá)課題組在前期研究工作中克隆和鑒定了與乳腺癌表型抑制相關(guān)的Claudin6 基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在鼠和人的乳腺癌細(xì)胞中此基因表達(dá)很低，推測(cè)Claudin6可能靶向作用于TJs，或許在抑制乳腺癌表型中能夠起到一定的作用。最新研究顯示，TJs 與某些人類腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前認(rèn)為，Claudins 家族不同成員在不同腫瘤中表達(dá)各不相同，所代表的生物學(xué)意義也有所不同[5]。為了探討Claudin6 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化技術(shù)對(duì)78例乳腺癌標(biāo)本和44例癌旁正常組織進(jìn)行Claudin6表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果顯示，Claudin6主要表達(dá)于乳腺組織的胞膜和胞漿中，而在乳腺癌組織中Claudin6 多表達(dá)于胞漿。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Claudin6在乳腺癌的表達(dá)（陽性率66.67%）低于癌旁正常組織（陽性率88.64%），但差異無顯著性（P>0.05）。這也為后續(xù)研究Claudin6在乳腺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床治療提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 駱麗，馬國榮，劉鳳閣，等. 緊密連接蛋白-1、3、4在乳腺癌患者中的表達(dá)及其臨床意義[J]疑難病雜志，2017.16（6）.610-613

[2] 邢曉輝，李力仙，郭天林.等.Claudin蛋白在緊密連接中的作用機(jī)制及與疾病的關(guān)系[J/OL].中華臨床醫(yī)師雜志·電子版，2013.7（23）：10839-10841

[3] 劉麗麗，趙霞.Claudin蛋白在卵巢癌中的研究進(jìn)展[J].四川解剖學(xué)雜志，2014，22（ 1） ：

22-25.

[4] 于鳳嬌，達(dá)林泰Claudins 蛋白與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究進(jìn)展[J] 醫(yī)學(xué)綜述，2017 .7（23）.

1316-1319

[5] 劉亞芳，李久霞，張廣超.等.緊密連接蛋白CLDN6在卵巢癌、肝癌以及腦膜瘤組織中的表達(dá)及意義[J] 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）2010.7（4）.698-702