趙留濤，陳五常，韓冰倩，袁之潤，吳冠連，吳洪銀，張 坤，吳春麗,4

(1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.商丘愛己愛牧生物科技股份有限公司，河南 虞城 476300；3.鄭州愛己愛牧生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001；4.鄭州市新型獸藥制劑創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001)

北芪五加顆粒有補(bǔ)中益氣、扶正祛邪的功效，用于提高禽機(jī)體免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果。北芪五加顆粒處方由黃芪和刺五加2味藥材組成，其中具有益氣健脾、補(bǔ)腎、安神功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，刺五加具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗疲勞、抗輻射等作用[2]；刺五加主要含有刺五加總苷，包括紫丁香苷、異嗪皮啶和刺五加苷E等成分[3-4]。本試驗(yàn)參考了有關(guān)文獻(xiàn)[5-8]，以紫丁香苷為指標(biāo)，采用高效液相色譜法(HPLC)測定其含量，測定北芪五加顆粒中紫丁香苷的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；METTLER TOLEDO AB135-S萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。紫丁香苷對照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號：111574-200603，規(guī)格：供含量測定用)；甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱phenomenex 00G-4435-E0(250 mm×4.60 mm×5 μm)；流動相：甲醇-水 (20∶80)為流動相；檢測波長為265 nm。理論板數(shù)按紫丁香苷峰計(jì)算不低于2 000。

1.2.2 紫丁香苷對照品溶液的制備 精密稱取紫丁香苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL中含紫丁香苷20 μg/mL的溶液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取5.0 g，精密稱定，置小燒杯中，用50%甲醇40 mL，分次溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)10 min，取出，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 陰性對照溶液制備 依據(jù)處方中的比例，按制法制備缺刺五加的陰性對照樣品，按1.2.2項(xiàng)操作制備陰性對照溶液。按照上述色譜條件，分別注入色譜儀測定，結(jié)果陰性樣品色譜在與紫丁香苷峰相應(yīng)的保留時間附近無干擾峰檢出。

1.2.5 測定法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)法計(jì)算，即得。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性考察 照上述1.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取陰性對照溶液 10 μL、供試品溶液 10 μL、對照品溶液 10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對照溶液在紫丁香苷對照品相應(yīng)的保留時間處無干擾，見圖1、圖2、圖3。

圖1 陰性對照色譜圖Fig.1 HPLC of negative control

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取紫丁香苷對照品適量，分別制成濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的對照品溶液，分別進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量10 μL，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，紫丁香苷濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程，Y=0.421 6X-0.054 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，不小于0.999。試驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，紫丁香苷在5.05 μg/mL～80.75 μg/mL范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，結(jié)果見圖4。

圖2 紫丁香苷對照品色譜圖Fig.2 HPLC of syringin reference

圖3 紫丁香苷供試品色譜圖Fig.3 HPLC of syringin for the test sample

圖4 紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of syringin

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取紫丁香苷對照品溶液 10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，測得紫丁香苷峰面積RSD為0.09%，結(jié)果表明，本方法精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性 取同一批號供試品，按供試品溶液制備方法制備6份供試液，分別進(jìn)樣測定紫丁香苷峰面積，并分別計(jì)算紫丁香苷含量和含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為1.85%，小于2.0%。結(jié)果顯示，所建立方法的重現(xiàn)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24 h時測定紫丁香苷峰面積，并分別計(jì)算含量和含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為1.88%，小于2.0%，表明24 h內(nèi)供試品溶液中紫丁香苷的含量基本穩(wěn)定。結(jié)果顯示，制備的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 回收率 取同一批號已知含量供試品(紫丁香苷含量181.44 μg/g)20 g，研細(xì)，混勻，取2.5 g，精密稱定，共取6份，分別加入紫丁香苷對照品儲備液1 mL，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量10 μL，測定紫丁香苷峰面積并計(jì)算紫丁香苷含量，再計(jì)算加樣回收率，測得平均回收率為100.43%，RSD為1.18%。表明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)Table 1 Recovery rate of samples (n=6)

2.1.7 樣品含量測定 取20110201、20110202和20110203三個批號供試品，按照1.2.5項(xiàng)下的方法制備供試品溶液并測定，計(jì)算紫丁香苷的含量，含量分別為179 μg/g、180 μg/g、184 μg/g。

3 討論

3.1 供試品處理方式的選擇 通過比較水、甲醇、50%甲醇、乙醇為提取溶劑，結(jié)果采用50%甲醇作為提取溶劑提取效果最好?？疾炝顺曁幚?10 min、20 min、30 min、1 h，結(jié)果表明，超聲30 min紫丁香苷基本提取完全且雜質(zhì)相對較少，故供試品的提取方法超聲 30 min。

3.2 測定波長的選擇 紫丁香苷在223 nm、265 nm處有最大吸收，考察發(fā)現(xiàn)在265 nm下紫丁香苷即使保留時間較短，也不存在干擾峰，其他雜質(zhì)峰較少，圖譜效果好，故選擇檢測波長為 265 nm。并參考有關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，紫丁香苷在 265 nm處有最大吸收，且紫丁香苷峰無干擾，故選擇 265 nm為檢測波長。

3.3 流動相的選擇 參照文獻(xiàn)[12-16]等試驗(yàn)研究中HPLC法測定紫丁香苷的流動相，結(jié)果表明，流動相為甲醇∶水(20∶80)時，則分離度明顯提高，且紫丁香苷的峰形較好，與相鄰峰能達(dá)到基線分離。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜法測定北芪五加顆粒中紫丁香苷的含量，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可以作為北芪五加顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)。