張 樺，王 利，李 娟，傅 芳

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041)

泡囊短波單胞菌(Brevundimonasvesicularis)是一種較罕見的非發(fā)酵性病原性假單胞菌，按照新版伯杰手冊，根據(jù)RNA同源性分類為假單胞菌科rRNA同源群4，為微小假單胞菌DNA同源群泡囊短波單胞菌[1]。該菌被認為有機會成為全球新型的機會致病菌，在宮頸炎、皮膚病、泌尿道疾病、血流感染、胸腔、心包腔及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等感染中均有發(fā)現(xiàn)[2-6]。在2010年，Popowska M等[7]發(fā)現(xiàn)土壤中存在著對四環(huán)素具有較高抗性的泡囊短波單胞菌。近年來，對泡囊短波單胞菌的研究主要集中在人類疾病上[8-11]，而在水生動物中僅有1例基于泡囊短波單胞菌對蘭·坎皮海龜?shù)腎gY滴度產(chǎn)生影響的研究[12]。

鯽魚(Carassiusauratus)是一種雜食性的淡水魚，為輻鰭魚綱鯉形目鯉科鯽屬的一種魚類[13-14]。由于鯽魚大規(guī)模養(yǎng)殖，且隨著養(yǎng)殖密度的不斷擴大，越來越多的疾病在魚身上暴發(fā)。其中細菌性疾病是最為嚴重的傳染性疾病，許多文獻報道的魚類細菌性病原主要包括普通變形桿菌、嗜水氣單胞菌和魯氏耶爾森氏菌等[15]；對魚類病理組織觀察也只是在細菌性敗血癥、嗜水氣單胞菌感染[16]。本試驗是以患病的黃顙魚中分離得到泡囊短波單胞菌菌株，人工感染鯽魚，探討其對鯽魚的病理組織學損傷，為魚類泡囊短波單胞菌的感染防控提供科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)試驗菌株:于西南民族大學武侯校區(qū)第二實驗樓水族箱的患病黃顙魚中分離出的1株菌，命名為Z1，經(jīng)鑒定為泡囊短波單胞菌，保存于-80 ℃ 超低溫冰箱中備用。(2)試驗動物:從成都某養(yǎng)殖場購置的健康鯽魚20尾，飼養(yǎng)于西南民族大學武侯校區(qū)第二實驗樓。鯽魚的體長(20±5)cm，體重為(250±5)g。眼觀體表完整、健康良好。(3)試驗試劑:LB培養(yǎng)基、瓊脂粉、多聚甲醛、甘油，購自成都市科龍化工試劑廠；二甲苯，購自天津市致遠化學試劑有限公司；無水乙醇，購自成都海興化工試劑廠；蘇木素染液、伊紅染液(醇溶)、中性樹膠，均購自合肥新恩源生物技術有限公司；1.1×T3 Super PCR Mix，購自北京天根生化科技有限公司；16S rDNA引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株懸浮液的制備 取保種的泡囊短波單胞菌Z1 100 μL接種于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)12 h，于分光光度計中測定其OD600值。將測定的吸光度帶入其活菌數(shù)的OD600值標準曲線，得到菌液濃度。最后用0.85%的生理鹽水將菌液濃度調(diào)至5.0×107CFU/mL[17]。

1.2.2 動物試驗 試驗鯽魚在實驗室暫養(yǎng)1周，將其隨機分成對照組和試驗組，每組各10尾，飼養(yǎng)條件一致。在飼養(yǎng)期間均給鯽魚的正常生長條件，每天定時投喂飼料，3 d換水1次。參照1.2.1配制成的5.0×107CFU/mL的菌液，試驗組每尾給予0.2 mL的菌液腹腔注射，對照組給予同等體積的0.85%生理鹽水腹腔注射。觀察鯽魚的臨床癥狀并做好相關試驗記錄。

1.2.3 病理切片的制作 觀察鯽魚的精神狀況、食欲狀態(tài)、活動情況、死亡情況。對感染發(fā)病魚進行組織病理學觀察，即取感染發(fā)病魚的脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肌肉，先固定于4%的多聚甲醛溶液中24 h以上，再分別于50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ脫水1 h，隨后在二甲苯與無水乙醇的1∶1混合溶液中透明15 min，再在二甲苯中透明20 min，最后浸蠟、包埋、切片和H.E.染色。試驗期間做好臨床癥狀、剖檢癥狀、病理組織癥狀的記錄。

1.2.4 細菌的分離鑒定 在無菌環(huán)境下，用接種環(huán)分別穿刺試驗組感染發(fā)病魚的脾臟、肝臟、腎、心臟和腹腔積液，劃線于LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。之后對平板里的菌按照常規(guī)操作進行分離和純化，挑取形狀、顏色、大小相近的單菌落并命名為Z2，于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)12 h。運用16S rDNA通用引物對分離到的Z2菌進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，有目的條帶，然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

2 結果

2.1 臨床癥狀 在感染24 h后，試驗組鯽魚開始出現(xiàn)精神不佳、活動能力減弱、食欲減退、體表黏液增多、皮膚泛黃、局部出血、肛門紅腫、魚鰭基部有出血點、爛尾、魚鱗脫落、腹部腫脹、體表充血等臨床癥狀(見中插彩版圖1)。48 h后，感染魚開始出現(xiàn)死亡。對照組無病理變化現(xiàn)象。

2.2 剖檢癥狀 對發(fā)病魚進行剖檢，眼觀均表現(xiàn)為皮下局部肌肉呈彌散性出血，腹部有大量積液；肝、胰臟顏色變深、腫大并伴有樹枝狀出血現(xiàn)象；腎臟易發(fā)生溶解且腎體積腫脹并伴隨有充血現(xiàn)象；脾臟腫大，顏色變深、變暗(見中插彩版圖2)。

2.3 病理組織學觀察 經(jīng)光學顯微鏡觀察，受感染鯽魚的肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、心臟均呈現(xiàn)出不同的病變情況，組織或者細胞基本都發(fā)生腫脹、充血、變性、壞死等主要病理變化(見中插彩版圖3)。肝臟經(jīng)光學顯微鏡觀察可知：肝細胞發(fā)生水腫變性且失去原有的細胞形態(tài)，細胞核體積增大并且部分細胞核被擠壓到細胞的一側，細胞質可見大小不一的空泡，肝血竇擴張充血，肝組織中有少量炎性細胞浸潤(見中插彩版圖3A)。脾臟經(jīng)光學顯微鏡觀察可知：脾臟組織結構疏松，淋巴細胞數(shù)量相對減少，紅細胞數(shù)量相對增多且?guī)缀醺采w整個脾臟組織。脾臟組織中還可見含鐵血黃素的沉積，提示脾臟有溶血現(xiàn)象。脾竇擴張出血，脾白髓的淋巴細胞變性(見中插彩版圖3B)。腎臟經(jīng)光學顯微鏡觀察可知：腎臟組織中炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞腫脹并伴隨有玻璃樣變性，細胞核體積增大，從組織切片中還可以看出腎小管上皮細胞有脫落現(xiàn)象。腎小球中充滿紅細胞，腎小管間質增厚，并有大量的紅細胞充盈期中，即發(fā)生了毛細血管閉鎖的現(xiàn)象。腎小管的管腔變狹窄，并有些腎小管的管腔中充斥著透明管型(見中插彩版圖3C)。心臟經(jīng)光學顯微鏡觀察可知：心肌細胞腫脹，細胞核濃縮，出現(xiàn)透明變性，細胞間隙變寬，心肌纖維呈不規(guī)則波浪狀條紋并且部分心肌纖維發(fā)生斷裂(見中插彩版圖3D)。肌肉組織經(jīng)光學顯微鏡觀察可知：肌細胞間隙增大且有紅細胞出現(xiàn)，肌纖維有斷裂現(xiàn)象且排列紊亂(見中插彩版圖3E)。

2.4 細菌的鑒定 分離的Z2菌16S rDNA基因擴增結果見圖4，測序所得基因的片段長度為1 375 bp。經(jīng)NCBI的BLAST比對之后發(fā)現(xiàn)其與泡囊短波單胞菌266XY4株的一致性最高，為98%，該菌為泡囊短波單胞菌，與注射菌株一致，從而判斷該菌株可引起鯽魚致病。

圖4 保種菌和分離菌的基因擴增產(chǎn)物Fig.4 Gene amplification products of preserved and isolated bacteriaM：DL-2 000 DNA Marker；1：泡囊短波單胞菌菌株Z1；2：感染魚中分離菌株Z2M:DL-2 000 DNA Marker;1:Brevundimonas vesicularis strain Z1;2:Strain Z2 isolated from infected fish

3 討論

泡囊短波單胞菌又名泡囊假單胞菌，是一種較罕見的非發(fā)酵性病原性假單胞菌。1994年，Segers等[18]將其劃歸于短波單胞菌屬。2018年，Ryan M P等[2]將其描述為一種新出現(xiàn)的全球條件致病菌。目前國內(nèi)外學者對泡囊短波單胞菌的研究主要集中在人體臨床感染等方面，2001年，于愛民等[19]從新生兒患者血標本中分離到1株泡囊短波單胞菌，發(fā)現(xiàn)其能致敗血癥并伴有抽搐、青紫等臨床現(xiàn)象。2003年，魏麗等[20]首次從臨床患者的尿液中分離出1株泡囊短波單胞菌，發(fā)現(xiàn)其能致尿路感染并伴有發(fā)熱、尿頻、尿急、尿不盡等臨床癥狀。2007年，馬學斌等[21]發(fā)現(xiàn)泡囊短波單胞菌能致關節(jié)腔感染并導致其腫大。2018年，Christiadi D等[8]報道了由泡囊短波單胞菌引起腹膜炎的治療。泡囊短波單胞菌的致病性通常發(fā)生于自身免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善、免疫力低下、大量應用廣譜抗菌藥物、皮質激素以及免疫抑制治療后的人群。本試驗將該菌通過腹腔注射至鯽魚腹腔組織，通過血液循環(huán)感染各組織，導致各組織出現(xiàn)變性、腫脹、出血等現(xiàn)象。由此分析鯽魚快速死亡的原因可能有以下3點：(1)鯽魚受到內(nèi)外環(huán)境變化的刺激以及受到致病菌的感染，導致體內(nèi)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，免疫力下降；(2)鯽魚受到致病菌的感染，導致體表出血、潰爛，從而增大鯽魚被其他一些致病菌感染的機會；(3)鯽魚受到致病菌的感染，導致鯽魚的各組織出現(xiàn)病理損害。這表明該菌對鯽魚有致病性。

本試驗中，發(fā)病鯽魚的臨床癥狀與患病的黃顙魚的臨床癥狀相似，如魚鰭基部有充血、出血、紅腫、潰爛現(xiàn)象，皮膚有出血點、肛門有紅腫、腹部腫大等，這與任思宇等[22]的1例鯽魚細菌性敗血癥的病原學和病理學研究相似。通過光學顯微鏡觀察鯽魚各組織病理切片，發(fā)現(xiàn)受感染鯽魚的心臟、腎臟、脾臟、肝臟和肌肉都有不同程度的損壞。心臟心肌纖維排列紊亂，心肌細胞間隙增大。腎臟的腎小管上皮細胞腫脹、脫落、變性、出血、炎性細胞浸潤，這與申會剛等[23]的鯽魚嗜水氣單胞菌感染后脾、腎、肝的組織學病變及吞噬細胞的變化相似。脾臟的紅細胞數(shù)量增多，含鐵血黃素的沉積，這與趙靜等[16]黃顙魚感染小腸結腸炎耶爾森菌的脾臟病變有所區(qū)別。肝臟組織結構疏松，出血，肝細胞腫脹變性，這與曾燕玲等[14]鯽魚感染嗜水氣單胞菌的癥狀相似,與蔣自立等[15]嗜水氣單胞菌感染黃顙魚肝組織病變有所區(qū)別。肌肉組織的肌纖維排列紊亂，間隙增大。

綜上所述，本文探討了泡囊短波單胞菌對鯽魚各組織器官的病理性損傷，這將有利于為魚類泡囊短波單胞菌的感染防治提供科學參考。