熒光探針法研究蘆丁與DNA 的相互作用

喬春玉，張重越，閆 鵬*，朱傳勇

（1，黑龍江工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150050；2，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科，黑龍江 哈爾濱 150040）

前 言

DNA 是一種重要的遺傳物質(zhì)，也是許多藥物小分子在生物體內(nèi)發(fā)生作用的靶點,它特定的雙螺旋結(jié)構(gòu)是識別小分子與其作用的重點研究對象。近年來，藥物小分子與DNA 相互作用研究得到了廣泛的關(guān)注[1～2]。藥物分子與DNA 作用機(jī)理的研究對于闡明藥物分子對DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程的影響以及DNA 靶向藥物分子設(shè)計提供重要的參考信息。

蘆?。ńY(jié)構(gòu)見圖1）又稱為蕓香甙，維生素P，紫槲皮甙，路丁，路通等。是廣泛存在于植物中的黃酮醇配糖體，是淡黃色或淡綠色針狀結(jié)晶或結(jié)晶粉末。其藥用價值也很高，如槐米中的蘆丁，能降低血管的脆性、改善血管的通透性、降低血脂和膽固醇，用于防治老年高血壓和腦溢血。本文以溴化乙錠（EB，結(jié)構(gòu)見圖2）做為探針，利用光譜法對蘆丁（rutin）與DNA 的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了研究。

圖1 蘆丁的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The molecular structure of rutin

圖2 EB 的結(jié)構(gòu)式Fig. 2 The molecular structure of EB

1 實驗部分

1.1 試劑

鮭魚精DNA，溴化乙錠，蘆丁。除非特殊注明，本實驗所用的DNA 為雙螺旋DNA，試劑均為分析純。

1.2 儀器

RF-5301 PC 熒光光度計，GBC Cintra 10e 紫外- 可見光譜儀，烏氏黏度計，pHS-3C 數(shù)字酸度計，電子恒溫水浴鍋。

1.3 實驗方法

采用紫外法研究DNA 的熔點曲線，監(jiān)測DNA、以及DNA- 蘆丁的最大紫外吸收峰，實驗中每隔2～5℃記錄一次讀數(shù)。

按照選定的濃度比，在含有DNA-EB 的溶液中，加入適量的蘆丁，配制一系列含有不同濃度的蘆丁而DNA-EB 溶液的濃度保持不變的分析試液，分別測定溶液在15℃，25℃，35℃和45℃的熒光光譜。

固定DNA 的濃度，將不同濃度的蘆丁加入到溶液中，測定蘆丁對DNA 黏度的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA 熔點的研究

實驗采用紫外法研究DNA 的熔點曲線。通過加熱的方法使DNA 變性，當(dāng)雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為該DNA 的熔點，用Tm 表示。DNA 發(fā)生變性時，表現(xiàn)為增色效應(yīng)。當(dāng)達(dá)到Tm 時，DNA 分子內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)打開，即增色效應(yīng)達(dá)到一半時的溫度。

圖3 蘆丁不存在和存在的情況下DNA 的熔點變化曲線Fig. 3 The melting curves of DNA in the absence of rutin（a）and in the presence of rutin（b）.

實驗分別測定了DNA、DNA- 蘆丁的熔點，如圖3 所示。通常小分子與DNA 相互作用能夠影響其熔點Tm，其中嵌入式作用能使DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，Tm 會增加5～8℃，但是非嵌入作用不能使熔點溫度有明顯的增加[3]由圖3 可以看出，當(dāng)向DNA 溶液中加入蘆丁后，DNA 體系的熔點溫度明顯增加。由此，我們可以判斷蘆丁與DNA 的結(jié)合作用是嵌入式的的結(jié)合。

2.2 熒光性質(zhì)的研究

實驗首先測定了一組含一定濃度EB 而不同濃度DNA 溶液的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4 所示。由圖可見，溶液的熒光強(qiáng)度隨著DNA 的加入逐漸增強(qiáng)，并且當(dāng)DNA 的加入量達(dá)到一定值時，體系的熒光強(qiáng)度不再增加，這表明EB 與DNA 的結(jié)合已經(jīng)趨于飽和。

圖4 EB 的熒光強(qiáng)度隨DNA 濃度的增加而增加Fig. 4 The fluorescence intensity of EB with the increasing concentration of DNA

圖5 蘆丁存在時DNA-EB 的熒光光譜Fig. 5 The fluorescence spectra of DNA-EB in the presence of rutin

在選定的實驗條件下，分別測定DNA-EB 體系在加入蘆丁前后的熒光譜圖，結(jié)果見圖5。由圖可以看到，隨著蘆丁濃度增大，DNA-EB 溶液的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，說明蘆丁與DNA-EB 發(fā)生相互作用并形成新的復(fù)合物。根據(jù)猝滅機(jī)理可將熒光猝滅分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種，猝滅常數(shù)隨溫度升高而減小的為靜態(tài)猝滅，反之則為動態(tài)猝滅[4]。

為了判斷反應(yīng)的猝滅機(jī)理，我們先假設(shè)蘆丁對DNA-EB 體系的猝滅過程是動態(tài)猝滅，那么其作用過程遵循 Stern-Volmer 方程[5]：

F0和F 分別是猝滅劑加入前后熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；Kq（單位：L·mol-1·s-1）是雙分子猝滅過程的速率常數(shù)；τ0是沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命，對于一般物質(zhì)而言，τ0≈10-8s；[Q]是猝滅劑的濃度；Ksv（單位：L·mol-1）是Stern-Volmer 猝滅常數(shù)。

圖6 是在不同溫度下，蘆丁猝滅DNA-EB 體系熒光的Stern-Volmer 曲線。由圖可見，Ksv值隨溫度的升高降低了，這說明蘆丁對體系熒光強(qiáng)度的猝滅不是動態(tài)猝滅。另外，通過計算得到25℃時蘆丁的Kq是 3.89×1012L·（mol·s）-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于動態(tài)猝滅最大碰撞猝滅速率常數(shù) 2.0×1010L·（mol·s）-1[6]，這進(jìn)一步表明蘆丁對DNA-EB 體系的熒光猝滅不是由于動態(tài)碰撞，而是源于兩者之間形成了復(fù)合物，即靜態(tài)猝滅過程。

圖6 在15℃（a）, 25℃（b）, 35℃（c）and 45℃（d）時蘆丁-DNAEB 的 Stern-Volmer 曲線Fig. 6 The Stern-Volmer curves at 15℃（a）, 25℃（b）, 35℃（c）and 45℃（d）of rutin-DNA-EB

圖7 蘆丁在不同溫度下1 /（F0- F）對[Q]-1 的一元擬合曲線Fig. 7 The plots of 1 /（F0-F）versus [Q]-1 for rutin at various temperatures

利用靜態(tài)猝滅公式[7]：

可得到不同溫度下的雙倒數(shù)Lineweaver-Burk圖，斜率KDF0-1與截距F0-1之比為KD，即熒光體與猝滅劑的解離常數(shù)，進(jìn)而就可以得到結(jié)合常數(shù)KA（KA=1/KD）。

圖7 是蘆丁與DNA-EB 體系在不同溫度下以1/（F0- F）對[Q]-1做的一元擬合。其結(jié)合常數(shù) KA列于表1 中。從表1 所示的結(jié)果可以看出，蘆丁與DNA-EB 的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而增加，這說明他們的結(jié)合是吸熱的反應(yīng)。

表1 蘆丁與DNA-EB 在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Table 1 The binding constants（KA）of the rutin with DNAEB at various temperatures

2.3 黏度實驗

黏度法是研究小分子與DNA 作用模式的另一種最有力的實驗方法，因為它對DNA 的長度變化比較敏感[8]。一般來說，如果小分子與DNA 通過經(jīng)典嵌入方式結(jié)合時，DNA 相鄰堿基對的距離會變大以容納插入的配體，導(dǎo)致DNA 雙螺旋鏈伸長，由此使DNA 溶液的黏度增大[9]；當(dāng)藥物分子以靜電、溝槽結(jié)合等非嵌入方式與DNA 作用時，DNA 溶液的黏度沒有明顯變化[10]。在25℃測定了蘆丁對DNA黏度的影響。被測液體的相對黏度按下式計算[11]：

其中：

η——被測溶液的相對黏度；

t0——緩沖液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間；

t——DNA 溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間。

根據(jù) Cohen 和 Eisenberg 理論[12]，以（η /η0）1/3對r 作圖，可以得到蘆丁對DNA 溶液黏度的影響，如圖8 所示。其中η0表示DNA 溶液的相對黏度，r是蘆丁與DNA 的結(jié)合比率。

結(jié)果表明，隨著蘆丁濃度的增加，DNA 溶液的黏度增大了。這進(jìn)一步說明，這蘆丁與DNA 的方式是嵌入式的。

圖8 蘆丁對DNA 相對黏度的影響Fig. 8 The effect on the relative viscosity of DNA in the presence of rutin

3 小 結(jié)

本文以EB 作為DNA 的熒光探針研究了蘆丁與DNA 相互作用的機(jī)理，通過熒光性質(zhì)的研究得到，蘆丁與DNA 的結(jié)合常數(shù)為3.72×104L·mol-1。通過熔點曲線，黏度測試驗證了蘆丁與DNA 的結(jié)合方式是嵌入式結(jié)合。