鄧祿軍，李金玲，夏錦慧，范士杰，謝永軍，韋忠斌

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴陽 550006；2.貴州省藥用植物繁育與種植重點(工程)實驗室，貴陽 550025)

牛大力(MillettiaspeciosaChamp.)又名血藤、血風(fēng)藤、倒吊金鐘、甜牛大力、甜牛力、美麗崖豆藤，為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤[1-3]，主要分布于福建、湖南、廣東、廣西、海南、貴州等地[4]。牛大力以干燥塊根入藥，性平、味甘，歸肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)虛潤肺、強(qiáng)筋活絡(luò)和健脾的功效[5]。牛大力為豆科植物，種子粒大飽滿，目前培育優(yōu)良種苗可通過種子發(fā)芽繁殖實現(xiàn)。近年來國內(nèi)外學(xué)者對牛大力萌發(fā)特性[6,7]、種質(zhì)資源[8]、生物學(xué)特性[9]、組織培養(yǎng)[10]、藥理毒理作用[11]、化學(xué)成分、分子生物學(xué)[12]、多糖提取工藝[13]等進(jìn)行了一定的研究。多年來，由于過度采挖，野生牛大力資源瀕臨枯竭，急需人工種植技術(shù)[14,15]。近些年在市場上供不應(yīng)求，人工種植面積不斷擴(kuò)大[7]，目前產(chǎn)區(qū)主要通過種子育苗擴(kuò)大種植，但由于牛大力種子發(fā)芽率相對較低，發(fā)芽不整齊，發(fā)芽后成苗率低，很大程度上增加了育苗成本，為了提高種子發(fā)芽成苗率、探索種子發(fā)芽后胚根生理變化和種子育苗應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

土壤鹽漬化是全球性的難題，是限制植物生產(chǎn)的主要影響因素之一[16]。添加外源物質(zhì)是緩解鹽脅迫的一種主要措施，并逐漸受到關(guān)注，成為研究和討論的熱點[17,18]。為此，開展鹽脅迫及外源供體硝普鈉對鹽脅迫下牛大力種子萌發(fā)胚根可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛及酶活性等生理指標(biāo)的影響，以期為了解外源SNP施用對鹽脅迫下牛大力種子萌發(fā)胚根的緩解效應(yīng)，并揭示其緩解機(jī)理，為深入研究牛大力幼苗的實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)，為鹽堿土壤上的牛大力栽培提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

牛大力種子來自江蘇省宿遷市沭陽縣顏集鎮(zhèn)，成熟種子。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗設(shè)計

牛大力種子洗凈消毒，用無菌水清洗備用。鹽處理對牛大力胚根的影響試驗，設(shè)定Na+濃度梯度為0、10、30、50、70、90 mmol·L-1，其中0蒸餾水(ck)，將處理好的種子點播于紙床培養(yǎng)皿中，加入相應(yīng)的Na+濃度梯度鹽溶液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為23 ℃。選定鹽脅迫濃度70 mmol·L-1，進(jìn)行外源SNP處理對鹽脅迫下牛大力胚根的影響試驗，將處理好的種子點播于紙床培養(yǎng)皿中，加入70 mmol·L-1Na+鹽溶液，再根據(jù)表1試劑加入相對應(yīng)的SNP濃度溶液，置于23 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

表1 不同濃度梯度外源SNP處理

1.2.2實驗方法

牛大力種子萌發(fā)6 d的胚根用生理鹽水冰浴研磨提取，4 ℃冷凍離心機(jī)4 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，放入4 ℃冰箱，備用。可溶性糖采用蒽酮比色法[19]測定；可溶性蛋白采用考馬斯亮蘭染色法[19]測定；脯氨酸采用茚三酮比色法[19]測定；丙二醛、POD、SOD均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源SNP對鹽脅迫下牛大力胚根可溶性糖的影響

由圖1可知，可溶性糖含量在鹽脅迫濃度為0時達(dá)到最高(54.15 mg·g-1)，之后隨Na+濃度升高呈降低—升高—降低變化的趨勢。其中，Na+濃度由10 mmol·L-1到50 mmol·L-1，可溶性糖含量由37.79 mg·g-1增加至52.61 mg·g-1；Na+濃度為50～70 mmol·L-1時可溶性糖含量急速下降，之后隨Na+濃度升高可溶性糖含量略有上升。

圖1 鹽脅迫下牛大力胚根可溶性糖含量變化

由圖2可知，在鹽脅迫濃度為70 mmol·L-1時，牛大力胚根可溶性糖含量隨外源SNP濃度的升高呈上升—下降的變化趨勢。其中，對照處理(SNP ck)的胚根，可溶性糖含量最高，為63.26 mg·g-1；ck處理下，胚根可溶性糖含量為43.58 mg·g-1；外源SNP濃度由20μmol·L-1到40μmol·L-1時，可溶性糖含量由62.15 mg·g-1增加至68.05 mg·g-1。可溶性糖含量在外源SNP濃度為40μmol·L-1時達(dá)到最大值；之后隨外源SNP濃度上升，可溶性糖含量緩慢下降。低濃度外源SNP不能增加鹽脅迫下牛大力胚根的可溶性糖含量；適量的外源SNP能夠促進(jìn)鹽脅迫下牛大力胚根的可溶性糖含量增加；鹽脅迫下高濃度外源SNP降低牛大力胚根的可溶性糖含量。從可溶性糖指標(biāo)看，外源SNP 在一定程度上可以有效緩解鹽對牛大力種子萌發(fā)的脅迫，最佳緩解濃度是40μmol·L-1。

圖2 外源SPN對NaCl脅迫下牛大力胚根的可溶性糖含量變化

2.2 外源SNP對鹽脅迫下牛大力胚根可溶性蛋白含量的影響

由圖3可見，牛大力胚根可溶性蛋白含量隨鹽脅迫濃度升高呈上升—下降的變化趨勢。其中，Na+濃度由0到50 mmol·L-1時，可溶性蛋白含量緩慢上升，由38.58 mg·g-1增加至48.77 mg·g-1，牛大力的抗逆性得到激活；Na+濃度由50 mmol·L-1到90 mmol·L-1時，可溶性蛋白含量迅速下降，由48.77 mg·g-1減少至30.20 mg·g-1，牛大力抗逆性出現(xiàn)衰減；在鹽脅迫濃度為50 mmol·L-1時，可溶性蛋白含量達(dá)到最高。

圖3 鹽脅迫對牛大力胚根可溶性蛋白含量變化

牛大力胚根在鹽脅迫下，可溶性蛋白含量隨外源SNP濃度的升高呈先下降后上升變化趨勢，并且逐步穩(wěn)定，見圖4。其中，SNP ck處理的胚根，可溶性蛋白含量達(dá)到最大，為36.68 mg·g-1；外源SNP濃度為0的胚根，可溶性蛋白含量為27.35 mg·g-1；外源SNP濃度為20μmol·L-1時的可溶性蛋白含量達(dá)最低值，為24.99 mg·g-1。外源SNP濃度由40 mmol·L-1到120μmol·L-1，可溶性蛋白含量由32.90 mg·g-1至33.50 mg·g-1，變化不大。

圖4 外源SNP對牛大力胚根可溶性蛋白含量變化

2.3 外源SNP對鹽脅迫下牛大力胚根脯氨酸含量的影響

由圖5可知，當(dāng)Na+濃度為0時，牛大力胚根脯氨酸含量最高，達(dá)77.12μg·g-1，之后隨鹽脅迫濃度升高呈先升高后降低的變化趨勢；在Na+濃度為50 mmol·L-1時，胚根脯氨酸出現(xiàn)二次峰值，為49.37μg·g-1。表明適量的鹽脅迫促進(jìn)了脯氨酸的積累。

圖5 鹽脅迫對牛大力胚根脯氨酸含量變化

由圖6可知，牛大力胚根在鹽脅迫下，脯氨酸含量隨外源SNP濃度的升高呈先上升后下降的變化趨勢。其中，ck處理的胚根，脯氨酸含量達(dá)到76.07μg·g-1；外源SNP濃度為0的胚根，脯氨酸含量最低，為23.81μg·g-1；外源SNP濃度由0μmol·L-1到40μmol·L-1時，脯氨酸含量急速上升，由23.81μg·g-1增加至79.30μg·g-1，且在外源SNP濃度為40μmol·L-1時脯氨酸含量達(dá)到最高；脯氨酸的積累有效地對抗鹽逆境脅迫，表明硝普鈉的加入緩解了鹽脅迫。

圖6 外源SNP對牛大力胚根脯氨酸含量變化

2.4 外源SNP對鹽脅迫下牛大力胚根丙二醛含量的影響

由圖7可知，牛大力胚根的丙二醛含量隨鹽脅迫濃度上升呈上升的變化趨勢。其中，Na+濃度由0到10 mmol·L-1時，丙二醛含量緩慢下降，由41.06μmol·g-1下降至35.37μmol·g-1；Na+濃度由10 mmol·L-1到90 mmol·L-1時，丙二醛含量逐漸升高。可見，牛大力胚根的丙二醛含量與逆境環(huán)境的傷害程度有密切相關(guān)性，表明鹽脅迫誘導(dǎo)丙二醛含量的積累，促進(jìn)膜脂過氧化對牛大力胚根的傷害。

圖7 鹽脅迫對牛大力胚根丙二醛含量變化

由圖8可知，外源SNP對鹽脅迫下牛大力胚根的丙二醛含量的影響呈先下降后緩慢上升的變化趨勢。與ck相比，NaCl處理下牛大力胚根中的丙二醛含量提高了89.57%；外源SNP濃度由0到40 mmol·L-1時，NaCl脅迫下牛大力胚根丙二醛含量由46.73μmol·g-1下降至35.23μmol·g-1；隨著外源SNP濃度增高丙二醛含量緩慢升高，當(dāng)外源SNP濃度為120μmol·L-1時，丙二醛含量未超過NaCl脅迫下SNP濃度為0處理，表明外源SNP的加入緩解了鹽脅迫對牛大力胚根的影響。

圖8 外源SNP對牛大力胚根丙二醛含量變化

2.5 外源SNP對鹽脅迫下牛大力胚根酶活性的影響

由圖9可以看出，牛大力胚根的POD活力隨鹽脅迫濃度上升呈先上升后下降的變化趨勢。其中，Na+濃度由0到50 mmol·L-1時，POD活力緩慢上升；Na+濃度由50～90 mmol·L-1時，POD活力迅速下降。在Na+濃度為50 mmol·L-1時，POD活力達(dá)到最大值。

圖9 鹽脅迫對牛大力胚根的POD活力變化

由圖10可知，牛大力胚根的POD活力在鹽脅迫濃度下，隨外源SNP濃度上升總體呈先上升后下降的變化趨勢。其中，ck是蒸餾水處理(對照)，POD活性較高；在鹽脅迫濃度下，外源SNP濃度從0到80μmol·L-1，POD活力逐漸升高，當(dāng)SNP濃度80μmol·L-1時，POD活力達(dá)88.20 U·g-1；而后隨著SNP濃度升高，POD活力下降。在鹽脅迫下，添加SNP后牛大力胚根POD活性均高于未添加處理，表明牛大力種子在鹽脅迫逆境環(huán)境中，添加外源SNP緩解了鹽脅迫對其胚根的影響。

圖10 外源SNP對牛大力胚根的POD活力變化

SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，該酶能清除超氧陰離子自由基，減少亞硝酸鹽的形成，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。鹽脅迫對牛大力胚根的SOD活力的影響見圖11，牛大力胚根的SOD活力隨鹽脅迫濃度上升呈先上升后下降的變化趨勢。SOD活力在Na+濃度由0到10 mmol·L-1時，先降低而后逐漸升高，當(dāng)Na+濃度50 mmol·L-1時達(dá)到最高，為825.20 U·g-1；隨著Na+濃度升高，SOD活力呈下降趨勢。

圖11 鹽脅迫對牛大力胚根的SOD活力變化

外源SNP對牛大力胚根的SOD活力的影響見圖12，ck處理牛大力胚根SOD活力最大；牛大力胚根的SOD活力在鹽脅迫濃度下，外源SNP濃度從0到80μmol·L-1，SOD活力逐漸升高；而后隨著SNP濃度升高，SOD活力下降。表明一定濃度的外源SNP可緩解牛大力胚根在鹽脅迫下的傷害。

圖12 外源SNP對牛大力胚根的SOD活力變化

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

種子萌發(fā)即胚根的產(chǎn)生是蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程，伴隨很多酶參與調(diào)控的生化反應(yīng)。已有研究結(jié)果證實，SOD是清除超氧陰離子自由基的重要酶，POD是清除H2O2的關(guān)鍵酶[20,21]，反應(yīng)了植物體內(nèi)代謝的變化，對植物的生長和發(fā)育有著重要的影響作用。在鹽脅迫下，植物因鹽傷害而使細(xì)胞膜受到損傷，產(chǎn)生大量的丙二醛，膜受傷害又產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基，此時植物的保護(hù)酶系統(tǒng)被激活。POD和SOD是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶，它們發(fā)揮協(xié)同作用，消除活性氧，保護(hù)植物膜系統(tǒng)。本實驗中，在鹽脅迫下，丙二醛含量逐漸上升，可溶性糖、脯氨酸含量變小，可溶性蛋白呈先升高后降低趨勢，這與李志萍等[22]研究的NaCl和Na2CO3對栓皮櫟種子萌發(fā)的結(jié)果相似。

SNP是一種常用的外源NO供體，NO作為一種信號分子和活性氧清除劑，能調(diào)節(jié)植物對生物和非生物脅迫的適應(yīng)及反應(yīng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，適量濃度的SNP緩解鹽脅迫對牛大力種子胚根的傷害，這與郭棟等[17]研究的結(jié)果一致。在鹽堿地進(jìn)行牛大力種子萌發(fā)與育苗，可適當(dāng)添加低濃度SNP，以緩解鹽脅迫對牛大力種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。

牛大力在廣東、福建、廣西、海南等地進(jìn)行人工種植，部分種植區(qū)域臨海較近，屬于鹽堿地，而牛大力種苗均采用種子育苗，開展鹽脅迫及外源SNP緩解鹽脅迫對牛大力胚根生理指標(biāo)的影響研究，在牛大力種子發(fā)芽關(guān)鍵時期，揭示其胚根生理代謝變化規(guī)律，為生產(chǎn)上獲得優(yōu)質(zhì)牛大力種苗提供理論基礎(chǔ)，對牛大力產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

3.2 結(jié) 論

中性單鹽(NaCl)脅迫對牛大力胚根生理指標(biāo)有一定影響。低濃度鹽脅迫促進(jìn)牛大力胚根可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量增加，而隨著鹽濃度增加，各指標(biāo)含量均出現(xiàn)不同程度的下降；牛大力胚根丙二醛含量隨著鹽濃度增大呈現(xiàn)上升變化；牛大力胚根SOD和POD活力隨著鹽脅迫濃度升高呈先升高再下降的變化趨勢。

適量添加外源SNP能緩解鹽脅迫對牛大力胚根的傷害。添加低濃度外源SNP能增加可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量，隨著外源SNP濃度增加，各指標(biāo)出現(xiàn)不同程度的下降；添加低濃度外源SNP牛大力胚根丙二醛含量下降，隨著SNP濃度增大丙二醛呈上升變化；牛大力胚根SOD和POD活力隨著外源SNP濃度升高呈先升高再下降的變化趨勢。