李盡文，宋代博，李苑華，麥鍵城，劉詠倩，李 莉

(廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院科研平臺(tái)服務(wù)管理中心，廣東 東莞 523808)

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷發(fā)展，人口老齡化的不斷加劇，惡性腫瘤已經(jīng)成為危害人類生命健康的主要原因之一[1]。宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中居第一位，近年來(lái)其發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)。主要原因是由于HPV感染，其次可能的原因包括性生活過(guò)早、多個(gè)性伴侶、多孕多產(chǎn)；外在因素例如抽煙、喝酒、熬夜等不良生活習(xí)慣；高脂肪、高熱量食品的過(guò)多攝入等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。傳統(tǒng)的癌癥治療方案包括：放療、化療和手術(shù)治療，但是放化療殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)人體正常細(xì)胞也會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的影響，會(huì)帶來(lái)如骨髓抑制、脫發(fā)等不良反應(yīng)；手術(shù)治療切除病灶會(huì)同時(shí)切除腫瘤周圍部分正常的組織，而且有淋巴轉(zhuǎn)移者預(yù)后差。因此急需尋找新的有效且毒副作用小的治療方式來(lái)抵抗癌癥。

伴隨著中醫(yī)中藥近年來(lái)的發(fā)展，中藥抵抗癌癥的作用也不斷被發(fā)掘，天然產(chǎn)物在治療癌癥過(guò)程中具有療效好、低毒性、藥源廣等優(yōu)勢(shì)。地黃是中藥方中一種常用的藥物，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效[3]。梓醇(catalpol)是地黃根的主要活性成分，屬于環(huán)烯醚萜類化合物?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎[4]、改善腦缺血[5]、抗阿爾茨海默癥[6]、抗糖尿病[7]等作用。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)梓醇具有良好的抗腫瘤活性，如抗卵巢癌[8]、肝癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10]等等。本文擬配制不同濃度的梓醇溶液，以宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，探究其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與處理分組

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株(南京科佰生物科技有限公司)；梓醇catalpol(上海源葉生物科技有限公司)；DMEM(Gibco)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；青鏈霉素雙抗(solarbio)；PBS(solarbio)；胰蛋白酶-EDTA消化液(solarbio)；MTT(BioFrox)；DMSO(solarbio)；Hoechst33342(南京碧云天生物公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)設(shè)備為37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，平均每?jī)商旖o細(xì)胞更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右用0.25%的胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化傳代處理，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 梯度濃度梓醇溶液的配制

稱取3.62 mg的梓醇標(biāo)準(zhǔn)品粉末加入1 mL的DMEM培養(yǎng)液，配成濃度為10 mmol/L的梓醇溶液，再按照實(shí)驗(yàn)要求依次將其稀釋到終濃度為0.25、0.5、1 mmol/L的梓醇溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3×104個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞經(jīng)孵箱孵育至貼壁生長(zhǎng)后，吸出原培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組(control)，加入完全培養(yǎng)基；梓醇高劑量處理組、梓醇中劑量處理組、梓醇低劑量處理組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。將細(xì)胞接種于12孔板中，設(shè)空白對(duì)照組、梓醇高、中、低處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，不同處理24 h利用倒置顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化以及Hoechst核染檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞凋亡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)高、中、低濃度梓醇溶液處理(24、48 h)后，吸去培養(yǎng)液，每孔用PBS潤(rùn)洗1～2次，避免殘留的藥物與MTT反應(yīng)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后每孔加入100 μL含 10% MTT (5 mg/mL)的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育。2～4 h吸去MTT溶液，每孔加100 μL DMSO后放入脫色搖床脫色10 min，置于酶標(biāo)儀中測(cè)定孔中細(xì)胞的OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。計(jì)算各組平均存活率并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。設(shè)置空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100%，按公式計(jì)算各組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值×100%

2.2 細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度梓醇處理24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔用PBS潤(rùn)洗1～2次，洗完孔內(nèi)留少量PBS溶液。隨即用倒置顯微鏡觀察不同處理組細(xì)胞的形態(tài)變化。

2.3 Hoechst33342核染鏡下細(xì)胞凋亡觀察

細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度梓醇處理24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔用PBS潤(rùn)洗1～2次，洗完孔內(nèi)留少量PBS溶液。每孔加入200 μL Hoechst33342溶液，避光孵育5～10 min，孵育結(jié)束后吸除Hoechst 33342染色液，用PBS洗滌2～3次，每次3～5 min，洗滌完留少許PBS在孔內(nèi)，然后直接在熒光顯微鏡下觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，用GraphPad Prism 8.0軟件分析，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)三次以上，結(jié)果采用單因素方差分析和t-test進(jìn)行分析，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 梓醇抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖

梓醇的結(jié)構(gòu)如圖1。為明確梓醇抗宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖效果，實(shí)驗(yàn)采用高、中、低不同濃度的梓醇以及空白對(duì)照處理HeLa細(xì)胞24、48 h，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度藥物處理后HeLa細(xì)胞的吸光度。如圖2所示，經(jīng)梓醇處理的細(xì)胞存活率明顯降低，與空白對(duì)照組相比梓醇以時(shí)間和劑量依賴性抑制HeLa細(xì)胞的增殖。

(A)2D結(jié)構(gòu)，(B)3D結(jié)構(gòu)

圖2 梓醇對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

3.2 梓醇誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞形態(tài)改變

不同濃度的梓醇溶液處理細(xì)胞后，顯微鏡下觀察到隨著梓醇濃度的增加，HeLa細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞開(kāi)始收縮，核膜裂解并出現(xiàn)核固縮等凋亡形態(tài)變化，如圖3所示。

圖3 梓醇對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

3.3 梓醇誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡小體的產(chǎn)生

用Hoechst33342染液對(duì)不同濃度梓醇處理24 h的HeLa細(xì)胞進(jìn)行染色，如圖4所示，在熒光顯微鏡下梓醇高、中、低處理組均可明顯觀察到細(xì)胞核呈濃染致密的顆粒塊狀熒光，顯示有凋亡小體的形成。實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，梓醇能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖4 梓醇對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

4 討論

通常認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是由于癌細(xì)胞不受調(diào)控、無(wú)限增殖，腫瘤細(xì)胞中抑癌基因被抑制，而癌基因和原癌基因則被激活處于過(guò)表達(dá)狀態(tài)，這些基因的變化和腫瘤的發(fā)生密不可分。細(xì)胞凋亡是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞發(fā)生的程序性死亡。它受到嚴(yán)格的調(diào)控，涉及到一系列基因的激活或抑制、蛋白差異表達(dá)與相互作用以及信號(hào)通路的改變。細(xì)胞凋亡與腫瘤的關(guān)系同樣密切，腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制不能正常運(yùn)行，導(dǎo)致腫瘤無(wú)法通過(guò)凋亡路徑被清除。因此通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡對(duì)于藥物發(fā)揮抗腫瘤作用具有十分重要的意義。Yan[11]等研究發(fā)現(xiàn)蟾毒靈下調(diào)Cbl-b誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤的作用；Gao等[12]的研究表明雷公藤甲素能夠上調(diào) Bax同時(shí)下調(diào) Bcl-2 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞凋亡；馮[13]等人研究發(fā)現(xiàn)半夏提取物能有效抑制白血病細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，從而在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。

5 結(jié)論與展望

綜上所述，梓醇作為一種中藥單體化合物，能夠以時(shí)間和劑量依賴性來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，并且通過(guò)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡而殺滅腫瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)抵抗癌癥的作用。實(shí)驗(yàn)為梓醇抗腫瘤的藥理作用提供一定的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)，但是其抗腫瘤作用分子機(jī)制以及體內(nèi)抗腫瘤的作用尚未可知，需待進(jìn)一步研究探索。