馬 健，李 嬌，姜 晶

（沈陽農(nóng)業(yè)大學 園藝學院/設施園藝省部共建教育部重點實驗室/遼寧省設施園藝重點實驗室，沈陽 110161)

生物在基因組進化和適應環(huán)境的過程中，有功能的基因會存在串聯(lián)重復而形成一類串聯(lián)重復基因。研究發(fā)現(xiàn)，植物基因組中串聯(lián)重復事件發(fā)生頻率較高，這帶來了植物基因組中基因拷貝數(shù)的增加和等位基因的變異[1]。在擬南芥和水稻基因組中，串聯(lián)重復機制對脅迫耐受性和膜功能基因的擴張有很大的影響[2-3]。NBS-LRR抗病基因家族在茄科和十字花科植物中都存在串聯(lián)重復，這對家族進化起著非常重要的作用[4]。對于復雜的功能串聯(lián)重復序列－串聯(lián)重復基因的研究，可以揭示植物的重要性狀及表型相關的基因／基因家族的形成機制或演化規(guī)律。

小熱激蛋白(sHSPs)最為人所知的是對細胞應激的早期反應，作為不依賴ATP 的分子伴侶，可延遲有害蛋白質(zhì)聚集體的形成，以響應應激源[5]。sHSPs 的分子量大小均在12～42kDa 之間，因此也將其稱為HSP20。該家族成員包含ACD 結構域，這個結構域是以具有典型的β-sandwich 結構的低聚物組成的一個空心球，作為分子伴侶的功能，有助于蛋白質(zhì)折疊和防止其靶蛋白的聚集[6]。此外，sHSPs 本身非常敏感，它們的活性以及它們的蛋白質(zhì)水平會被細胞所處環(huán)境激活[7]。最初sHSPs 是在熱應激過程中上調(diào)的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)并且組成型表達。sHSPs 在熱激蛋白中含量最為豐富，與植物耐熱性關系密切，正常生長條件下，大多數(shù)sHSPs 在植物組織中不積累，而在熱激或其他脅迫下，sHSPs 含量迅速增加。研究表明，高溫脅迫下sHSPs 能自發(fā)形成大小為200～300kDa 的同源寡聚體，并與其他分子伴侶相互作用，幫助受損蛋白重新折疊[8]。在分子水平上，sHSPs 基因可對細胞活性進行瞬時的重新編程，其特征是伴隨熱激蛋白(HSP)的合成進而停止合成正常蛋白質(zhì)。HSP 的一個共同特征是它們以劑量依賴性方式進行積累，足以達到保護細胞的水平。HSP 基因的表達主要受轉錄水平控制，并且需要轉錄水平機制與特定轉錄因子相互作用，熱應激因子(HSF)在控制HS 反應中起關鍵作用[9]。位于5′末端的轉錄調(diào)節(jié)序列包括HS 響應元件(HSEs)和AT-rich 區(qū)域分別負責基因的熱誘導性和感應熱誘導性。已有關于擬南芥和水稻的sHSPs 基因家族基因表達數(shù)據(jù)表明，雙子葉植物和單子葉植物之間的I 類細胞質(zhì)sHSPs 基因成員具有明顯的時空分布特異性[10-11]。

番茄sHSPs 基因家族42 個成員中存在有兩組串聯(lián)重復基因，其中分別是SlHSP49.3/Sl-HSP39.4 和SlHSP17.7A/SlHSP17.6A/SlHSP17.6B/SlHSP17.6C[5,13]。其中 SlHSP17.7A/SlHSP17.6A/SlHSP17.6B/SlHSP17.6C 的基序排列高度一致，而這組氨基酸序列具有高度保守性的串聯(lián)基因簇的功能尚不清楚。本研究系統(tǒng)分析番茄中四個串聯(lián)重復基因Sl-HSP20 基因的表征和特性，根據(jù)基因的5′末端富含對激素響應的順式作用元件，比較該基因簇在激素處理、糖分響應的差異以及該基因簇在番茄果實發(fā)育和成熟階段的共表達基因，以期為進一步分析sHSPs 的進化起源及其功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試Micro-Tom 番茄，取自沈陽農(nóng)業(yè)大學蔬菜分子生物學番茄課題組。種子催芽時分別在水浴鍋55℃熱激20 min，待水溫降為室溫后于28℃恒溫箱培養(yǎng)，早晚控水洗種。培養(yǎng)48h 后，待70%以上的種子露白后，播于50 孔穴盤。培養(yǎng)于沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院蔬菜分子生物學組培室，溫度25℃，光周期為16h/8 h(晝/夜)，光照強度 120 μmol·m-2·s-1。

1.2 方法

1.2.1 番茄SlHSP20 基因簇的鑒定及理化性質(zhì) 利用tBLASTn 程序在番茄基因組中鑒定SlHSP20 基因簇成員，Solyc06g076520，Solyc06g076540，Solyc06g076560 和 Solyc06g076570(分別命名為 SlHSP17.7A，SlHSP17.6A，SlHSP17.6B 和SlHSP17.6C)。運用ExPASy(http://expasy.org/)在線工具預測鑒定番茄SlHSP20 基因簇氨基酸序列蛋白質(zhì)長度、分子質(zhì)量等理化性質(zhì)。根據(jù)SGN(http://solgenomics.net/)鑒定染色體定位、染色體分布、分子量、等電點和β 折疊數(shù)量等。

1.2.2 番茄SlHSP20 基因簇系統(tǒng)系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建及基序分析 將獲得的番茄SlHSP20 基因簇的氨基酸序列保存為FASTA 格式文件，通過MEGA6.0 軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)對基因簇進行系統(tǒng)進化樹分析。模式采用“Poisson correction”，缺口設置為“Pairwise Deletion”，校驗參數(shù)為 Bootstrap=1000，去除 bootstrap 支持率低于60%的節(jié)點。利用ClustalX 軟件對番茄SlHSP20 成員進行多重序列比對，并人工校正。利用MEME(http://meme-suite.org/)軟件分析番茄SlHSP20 基因家族成員基序類型和排列順序，獲得番茄SlHSP20 基因家族基序特點。

1.2.3 番茄SlHSP20 基因簇染色體定位分析 根據(jù)獲得番茄SlHSP20 基因組信息，利用番茄基因組數(shù)據(jù)(SGN,http://solgenomics.net，release v2.50)和軟件MapChart 2.3 定位分析番茄SlHSP20 基因簇染色體。

1.2.4 番茄SlHSP20 基因簇順勢作用元件分析 分析啟動子區(qū)域順式作用元件，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中下載番茄SlHSP20 基因簇ATG 上游2.0kb 序列作為啟動子序列，利用在線工具PLANT CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行順式作用元件分析。

1.2.5 SlHSP20 基因簇在番茄中表達分析 根據(jù)番茄表達數(shù)據(jù)庫(http://ted.bti.cornell.edu/)分析SlHSP20 基因簇在不同組織及果實生長發(fā)育不同時期的表達量。在番茄轉錄組綜合分析在線網(wǎng)站(http://tomexpress.toulouse.inra.fr/query) 中以SlHSP20 基因簇為誘餌使用對數(shù)標度的轉錄計數(shù)值和r 絕對值≥0.98 的閾值的皮爾遜相關系數(shù)進行基因的共表達分析[12]。

1.2.6 激素和外源糖誘導SlHSP20 基因簇表達分析 取果實綠熟期的番茄果實，用不銹鋼打孔器取果肉(直徑4 mm，厚度2 mm)，進行果肉孵育試驗，果肉圓片(包含果實維管束)放入20 mL 基礎緩沖液(MES 50 mmol·L-1pH5.5)，含 CaC125 mmol·L-1，MgC125 mmol·L-1，EDTA 5 mmol·L-1，抗壞血酸 5 mmol·L-1和甘露醇 200 mmol·L-1中平衡 30 min 后，在緩沖液中做以下處理：分別加入 IAA 50 mg·L-1、GA 50 mg·L-1、ABA 50 μmol·L-1、MeJA 50 μmol·L-1、ETH 50 μmol·L-1、SA 50 μmol·L-1、果糖(F) 50mg·L-1、葡萄糖(G) 50mg·L-1、蔗糖(S) 50mg·L-1，在室溫下孵育8h 和24h。取果肉圓片，用濾紙吸干表面水分，液氮速凍保存(-80℃冰箱)，用于后續(xù)基因表達分析。

總RNAs 的提取使用天根公司的植物總RNA 提取試劑盒(Tiangen，中國)，具體步驟參照制造商的說明?？俢DNAs 的獲得使用天根公司的Fast King RT Kit 反轉錄試劑盒，具體步驟參照制造商的說明。實時熒光定量PCR 使用SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒 (Tiangen，中國)，sHSPs 基因的實時熒光定量PCR 引物使用Primer Express 軟件設計，并委托鴻訊生物公司合成，純合方式為OPC 級，質(zhì)量為2 OD。使用儀器為Bio-Rad CFX ManagertTM Software 實時定量PCR 儀，具體步驟參照制造商的說明。選擇內(nèi)參基因為Actin，所有反應進行3 次生物學重復，做陰性對照并且添加溶解曲線來驗證PCR 產(chǎn)物的特異性。

SlHSP17.6A 正向引物 5′-GAAGGAGGAAGTGAAAGT-3′和反向引物 5′-ATCCATCTTTGCGTTCTC-3′，SlHSP17.6B 正向引物 5′-TTTGCCAACACACGAATA-3′和反向引物 5′-GTAACAGTAAGCACTCCG-3′，SlHSP17.6C 正 向引物 5′-ATTAGGCTTCACAGTTTC-3′和 反向引物 5′-AGTAACAGTAAGCACTCC-3′，SlHSP17.7A 正向引物 5′-TTTGCCAACACACGAATA-3′和反向引物 5′-AGTAACAGTAAGCACTCC-3′。

2 結果與分析

2.1 番茄串聯(lián)重復SlHSP20基因簇鑒定

利用tBLASTn 在番茄基因組中鑒定4 個SlHSP20 基因，分析番茄基因簇中4 個串聯(lián)基因的氨基酸長度、分子質(zhì)量、不穩(wěn)定指數(shù)及等電點等，根據(jù)氨基酸的分子量大小分別對基因簇成員命名為：SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A?；虼爻蓡T均具有典型的β 折疊結構的保守ACD 結構域。根據(jù)基因組序列分析顯示番茄SlHSP20 蛋白大小一致，番茄 SlHSP20 基因簇(SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A) 蛋白編碼154 個氨基酸，分子質(zhì)量變化范圍為17.6～17.7kDa，其中SlHSP17.7A 分子量最大，為17.7kDa，番茄sHSPs 基因簇成員等電點變化為5.57～5.84 之間，等電點最低的是SlHSP17.6C，等電點為5.57，等電點最高的是SlHSP17.6B、SlHSP17.7A，等電點為5.84，說明番茄基因簇SlHSP20 蛋白為酸性(表1)。

表1 番茄SlHSP20 基因簇成員的鑒定Table 1 The identification of SlHSP20 gene members in tomato

根據(jù)同源性序列分析發(fā)現(xiàn)，基因簇成員基因序列具有高度的相似性，同源性達到95.74%。堿基序列比對發(fā)現(xiàn)4 個串聯(lián)重復的基因具有相同的基因結構，均不含內(nèi)含子，且CDS 序列與基因序列基本一致(圖1)。根據(jù)番茄SlHSP20 基因簇成員染色體的定位情況可知，在番茄第6 條染色體上發(fā)現(xiàn)4 個串聯(lián)重復的基因(SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和 SlHSP17.7A)形成了 1 個基因簇。

圖1 番茄SlHSP20 基因簇成員序列比對Figure 1 Sequence alignment of tomato SlHSP20 gene cluster members

2.2 番茄SlHSP20的4 個串聯(lián)重復基因系統(tǒng)進化及基序分析

對番茄SlHSP20 基因簇成員的進化樹分析顯示，SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 定位于CI 類亞族(細胞質(zhì)或細胞核)，說明這4 個串聯(lián)重復基因編碼的蛋白分布在細胞質(zhì)或細胞核中。根據(jù)SlHSP20基因簇進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 為4 個平行同源基因?qū)?圖2)。運用MEME 軟件在番茄sHSPs 蛋白中檢測到SlHSP20 保守基序個數(shù)為5 個，其基因簇成員的基序類型及排列順序高度一致，并且SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 基序類型相同和排列順序一致(圖2)，由圖3 可知在其基序中包含 8 個保守的 β 折疊結構(β2～β9)。

圖2 番茄SlHSP20 基因簇進化樹分析及蛋白基序類型Figure 2 Charging module circuit diagram

圖3 番茄SlHSP20 基因簇基序及保守結構域β 鏈分析Figure 3 Analysis of motif and β-chain region of conserved domain in tomato SlHSP20 gene cluster

根據(jù)氨基酸同源性分析，基因簇成員具有高度的同源性(圖4 和表2)。所有的SlHSP20 在C 端均具有共同保守的熱激序列,熱激序列又分為保守序列I 和保守序列II，中間有不同長度的親水結合域。保守序列I 都含有共同的M 殘基：Pro-X(14)-Gly-Val-Leu；保守序列II 的相似氨基酸殘基為：Pro-X(14)-X-Val/Leu/Ile-Val/Leu/Ile；保守序列 I 和 II 是植物 sHSPs 所共有的[7]。

圖4 番茄SlHSP20 基因簇氨基酸序列的多序列比對及保守結構域分析Figure 4 Multiple sequence alignment and conserved domain analysis of tomato SlHSP20 gene cluster

2.3 番茄SlHSP20基因簇順式作用元件分析

對番茄SlHSP20 的4 個串聯(lián)重復片段基因的啟動子序列進行分析，截取番茄 SlHSP20 基因簇(SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C、SlHSP17.7A)ATG 上游2000bp 序列，運用PLANTCARE 網(wǎng)站作順式作用原件功能預測，ABRE，ARE，CGTCA-motif，TGACG-motif，CAT-box，LTR，MBS，TGA-element，site，GARE-motif與生物脅迫相關，4 個串聯(lián)基因均含有脫落酸應答元件(ABRE)，茉莉酸應答元件(CGTCA-motif)，抗氧化應答元件(ARE)，其中 SlHSP17.7A、SlHSP17.6B 和 SlHSP17.6C含有低溫脅迫應答元件(LTR)，SlHSP17.7A 和SlHSP17.6A 含有干旱脅迫應答元件(MBS)，而SlHSP17.7A、SlHSP17.6A 和SlHSP17.6C 含有生長素應答元件 (TGA-element)，SlHSP17.6A 含有防御和壓力應答元件 (TC-rich repeats)，SlHSP17.6B 和SlHSP17.6C 含有赤霉素應答元件(GARE-motif)。SlHSP20 基因簇成員在響應非生物脅迫和抗性脅迫過程中起到了明顯的作用，說明該基因簇在響應生物進程中起著關鍵作用[7]。

表2 番茄SlHSP20 基因簇氨基酸序列兩兩比對Table 2 Comparison of amino acid sequence of SlHSP20 gene cluster in tomato %

表3 番茄SlHSP20 基因簇啟動子順式響應元件種類Table 3 Type of cis-response element in the promoter of SlHSP20 gene cluster

2.4 串聯(lián)重復SlHSP20基因簇在番茄中的表達分析

通過番茄基因數(shù)據(jù)庫(http://ted.bti.cornell.edu/)分析SlHSP20 基因簇在不同組織及果實生長發(fā)育不同時期的表達量（圖5）。SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 在葉根和花器官中表達量均很低，但在果實發(fā)育與成熟時期表達量呈現(xiàn)明顯的差異。在果肉部位SlHSP17.6A 表達較低，而SlHSP17.6B 和SlHSP17.6C在綠熟期(MG_35DPA)到紅熟期(Red_44DPA)表達量逐漸增強，而SlHSP17.7A 在果實綠熟期后一直處于較高的表達水平。在果實的外果皮和種子部位SlHSP17.7A、SlHSP17.6A、SlHSP17.6B 和SlHSP17.6C 隨著果實的發(fā)育和成熟表達量也隨之增強，其中SlHSP17.6A 較其他3 個基因的表達要弱。相比較而言，SlHSP17.7A 在果實中的表達量相對于SlHSP17.6A，SlHSP17.6B，SlHSP17.6C 明顯提高，其中在綠果期中SlHSP17.7A 的表達量是SlHSP17.6A 的表達量的20 倍。

圖5 SlHSP20 基因簇在番茄生長發(fā)育中的表達分析Figure 5 Expression analysis of SlHSP20 gene cluster in tomato

根據(jù)基因表達的相似性分析基因表達產(chǎn)物可能的相互作用關系，了解基因間相互作用網(wǎng)絡，利用轉錄組綜合分析在線網(wǎng)站(http://tomexpress.toulouse.inra.fr/query)信息，分析SlHSP20 基因簇成員在番茄果實發(fā)育過程中的共表達差異 （圖6）。SlHSP20 基因簇4 個成員在果實發(fā)育的共表達網(wǎng)絡中處于不同的作用區(qū)間。其中Solyc06g076570 (SlHSP17.7A) 可能的正相關互作基因有11 個，負相關互作基因2 個；Solyc06g076560(SlHSP17.6C)可能的正相關互作基因有4 個，負相關互作基因1 個；Solyc06g076540(SlHSP17.6A)可能的正相關互作基因有1 個，Solyc06g076520(SlHSP17.6B)可能的負相關互作基因有1 個。研究結果表明SlHSP20 基因簇成員氨基酸序列雖高度同源，但其結合的互作基因的蛋白產(chǎn)物卻不同，說明氨基酸的不同可能導致蛋白的空間構型改變進而影響了其功能的差異。

2.5 激素對番茄果實SlHSP20基因簇的表達分析

通過PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)在線分析軟件中分析其順式作用元件。結果表明，SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和 SlHSP17.7A，這 4 個 SlHSP20 基因的啟動子含有 12 種已知響應逆境脅迫的若干相關作用元件，其中一半以上為響應激素相關的順式作用元件，尤其是參與響應脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、乙烯(ETH)和茉莉酸甲酯(MeJA)。這說明 SlHSP20 在番茄對逆境脅迫的應激反應中起著重要作用。果實發(fā)育成熟過程中，生長素、脫落酸等發(fā)揮重要作用。為了探究激素對番茄果實特異SlHSP20 基因的調(diào)控作用，本研究利用番茄果實圓片進行了激素處理。通過外源施加脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、乙烯(ETH)、水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)等激素處理，對 4 個串聯(lián) SlHSP20 基因的表達變化進行分析(圖7)。

結果表明，在激素處理的綠熟期果實圓片中，ETH 能夠顯著誘導SlHSP17.6A 的表達，其表達量與對照相比增加了近60%；而ABA 可顯著抑制SlHSP17.6A 的表達，其表達量下降約6 倍；其他激素處理對SlHSP17.6A的表達影響不大。SlHSP17.6B 在IAA 和MEJA 處理后表達受到明顯誘導，其中IAA 處理后SlHSP17.6B 相對表達量增加約6 倍，MEJA 處理后表達量增加約3 倍；在ABA 處理后，SlHSP17.6B 表達量降低63%；而其他激素處理下SlHSP17.6A 的表達沒有顯著變化。SlHSP17.6C 在ABA、ETH 和SA 處理后表達量受到明顯抑制，它們分別下降約為96%、81%和91%。SlHSP17.7A 在GA 和IAA 處理后，表達量顯著升高，分別增加約2.5 倍和6倍；而ABA、ETH 和SA 可顯著抑制SlHSP17.7A 的表達，受抑制程度分別下降約98%、51%和83%。以上結果表明，雖然SlHSP20 基因簇成員在序列上高度同源，但在番茄果實成熟期受激素調(diào)控的表達形式卻明顯不同。SlHSP20 基因簇能夠響應脫落酸、生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯、乙烯和水楊酸等激素的調(diào)控，說明其在相關激素調(diào)控通路上發(fā)揮著重要作用，并且在不同的外源激素處理下基因簇成員展現(xiàn)出明顯的差異性。

2.6 糖對番茄果實SlHSP20基因簇成員的表達調(diào)控

課題組前期對番茄的HSP20 基因家族成員的啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，SlHSP20 基因簇的4 個成員均含有一定數(shù)量的糖響應元件有SURE(糖響應元件)和W-box(蔗糖誘導蛋白元件)[5]。因此本研究進一步分析外源葡萄糖、果糖和蔗糖處理對番茄綠熟期果實圓片SlHSP20 基因簇成員的表達影響。由圖8 可知，綠熟期果糖處理8h后，SlHSP17.6A 表達量明顯增加，其相對表達量增加約 2.5 倍，而 SlHSP17.6B，SlHSP17.6C，SlHSP17.7A 均受明顯抑制。在葡萄糖處理后，SlHSP20 基因簇成員的表達均受到明顯抑制。在蔗糖處理后，SlHSP17.6A 表達量沒有顯著變化，而SlHSP17.6B，SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 的表達量也顯著降低。研究結果表明，雖然基因簇成員具有著高度的同源性，但在對糖的響應下基因簇成員表現(xiàn)出明顯不同的基因表達水平變化。

表4 SlHSP20 基因簇在番茄果實發(fā)育過程中共表達基因的相關性分析Table 4 Correlation analysis of gene cluster co-expressed SlHSP20 gene cluster during the development of tomato fruit

圖6 SlHSP20 基因簇在番茄果實發(fā)育過程中的共表達網(wǎng)絡分析Figure 6 Co-expression network analysis and expression of SlHSP20 gene cluster in the development of tomato fruit

圖7 激素對番茄果實SlHSP20 基因簇的表達影響Figure 7 Effects of hormones on the expression of SlHSP20 gene cluster in the fruits of tomato

圖8 糖對番茄果實SlHSP20 基因簇成員的表達影響（A.果糖;B.葡萄糖;C.蔗糖）Figure 8 Effect of sugar on expression of SlHSP20 gene cluster in tomato fruit(A.Fructose; B.Glucose; C.Sucrose)

3 討論與結論

本研究CI 類小熱激蛋白(sHSP)定位于番茄第6 條染色體上的無內(nèi)含子的基因簇SlHSP20，屬于低分子質(zhì)量的HSP20 家族。其數(shù)量和細胞定位的復雜性是高等植物熱激響應的獨特特征[7,9]。其中基因的復制轉化和倒置被認為是不同sHSP 基因起源的主要機制[7]。到目前為止，所有測序的基因組中都有基因重復的痕跡，并且基因重復被看做是導致生物進化進程復雜化的依據(jù)[14-16]。根據(jù)番茄數(shù)據(jù)庫Sl4.0 版本對SlHSP20 基因簇4 個串聯(lián)重復基因的結構和表達進行了分析，結果表明該基因簇在番茄基因組中以兩兩相反的方向編碼CI 類家族sHSP，其ORF 的長度完全相同，基因串聯(lián)排列。該基因簇具有序列高度相似性的事實表明他們是通過基因重復或者倒置而產(chǎn)生的。

對SlHSP20 基因簇中串聯(lián)的4 個基因的結構分析發(fā)現(xiàn)，該基因簇成員均具有保守的ACD 結構，且結構中帶有典型的β-sandwich 結構，這與前人在模式作物擬南芥、水稻的sHSPs 家族成員分布特點相同[10-11]?；虼爻蓡T具有高度同源的cDNA 序列和氨基酸序列，通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)SlHSP20 基因簇成員定位于細胞質(zhì)/細胞核的CI 類亞族。分析番茄SlHSP20 基因簇的進化關系發(fā)現(xiàn)基因簇成員間存在直系同源關系。這些結果說明SlHSP20 基因簇成員之間存在著廣泛的同源性和相似性，為深入研究SlHSP20 基因的功能提供了理論基礎。

GOYAL 等[2]曾對該段基因簇中的3 個基因的結構進行分析，但其結果中3 個基因轉錄方向相同，這與最新注釋的番茄數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)不符。本研究結果表明，該基因簇是在番茄基因組第六染色體中以兩兩相反的方向編碼CI 類家族sHSP。因此本研究根據(jù)新的基因注釋轉錄方向分析了5’-UTR 側翼區(qū)域順式作用元件，并利用綠熟期的果實圓片進行了激素處理。結果表明，SlHSP20 基因簇成員的表達對激素的響應都不同。事實上，真核生物中基因調(diào)控的主要機制是轉錄的激活，這主要是由于順式調(diào)控元件與轉錄因子相互作用的結果。因此，在對基因簇成員進行啟動子序列的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，在4 個基因的啟動子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了幾種（脫落酸，乙烯，茉莉酸，水楊酸，赤霉素和各種非生物和生物脅迫以及糖相關）的調(diào)控元件，這些元件與響應不同的脅迫誘導和影響基因表達有關[5,17]?；虻墓脖磉_分析網(wǎng)絡分析結果也表明，SlHSP20 基因簇成員的可能互作蛋白亦不同。SlHSP17.6A 互作的Solyc04g070990 編碼PHD-finger 蛋白，是一類在基因轉錄和染色質(zhì)狀態(tài)調(diào)控方面有重要作用的鋅指蛋白[17]。與SlHSP17.6B 互作的Solyc02g081400、Solyc03g043850、Solyc06g062690 的基因分別編碼胞內(nèi)蛋白酶PfpI 家族蛋白、細胞色素c 氧化酶亞基VIa 家族蛋白、核小體組裝蛋白等，主要作為伴侶蛋白和抗氧化因子等發(fā)揮作用。而與SlHSP17.6C 互作的可能基因產(chǎn)物類別更為廣泛，包括Solyc03g111010(編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、Solyc00g005050（編碼阿拉伯乳聚糖糖蛋白）、Solyc02g093490（編碼SAGA-相關因子）等多條途徑發(fā)揮作用。這說明高度同源的SlHSP20 基因簇成員，其在植物體中的功能或參與的信號轉導途徑可能也存在不同。但對于SlHSP20 基因簇成員的功能尚需通過基因編輯等手段進行深入的研究。