高 飛， 鄭永欽，曹 萍，賀軍棟，楊穩(wěn)莉 ，梁舒雯， 姚 嵐， 撒亞蓮*

[1.云南省第一人民醫(yī)院(昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院)a皮膚科;b臨床基礎(chǔ)研究所;c核醫(yī)學(xué)科,云南 昆明650032；2.石屏縣人民醫(yī)院 婦科; 3.昆明市中醫(yī)醫(yī)院 針灸科]

外陰陰道念珠菌病(VVC)是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1],每年數(shù)百萬(wàn)婦女受其困擾。已有研究表明，念珠菌的不同菌種對(duì)抗真菌藥的敏感性、耐藥性不同[2]。因此對(duì)菌種的鑒定非常重要。菌種鑒定的研究表明，真菌的ITS核苷酸較少出現(xiàn)變異，與權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，當(dāng)ITS區(qū)段核苷酸序列出現(xiàn)3%的閾值變化時(shí)，被視為新的菌種[3]。本研究采用科瑪嘉顯色培養(yǎng)法初步鑒定云南省石屏縣漢族和彝族VVC人群的念珠菌樣本，通過(guò)PCR擴(kuò)增真菌ITS1-ITS4片段測(cè)序后進(jìn)行念珠菌菌種鑒定。旨在了解石屏縣彝族VVC患者攜帶念珠菌的菌種構(gòu)成情況，為民族聚居區(qū)衛(wèi)生組織制定診治策略提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料143份樣本由2017年3月至2018年4月到云南省石屏縣人民醫(yī)院和石屏縣婦幼保健院經(jīng)培養(yǎng)確診為念珠菌陽(yáng)性的VVC患者提供。漢族患者的平均年齡34.00歲(16-49)；彝族患者的平均年齡32.00歲(16-50)。標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所白逢彥教授惠贈(zèng)(CGMCC 2.1801 季也蒙念珠菌，CGMCC 2.1846 近平滑念珠菌，CGMCC 2.1857 克柔念珠菌，CGMCC 2.1975 熱帶念珠菌，CGMCC 2.2086 白色念珠菌，CGMCC 2.2498 光滑念珠菌 )。離心機(jī)(Hitachi,CR22G)；PCR儀(ESCO AeristmG-96 well)；電泳槽和電泳儀(BG-Power 600i)；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad ChemiDoc XRS)；電熱恒溫三用水箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠，HH-W21 600型)；測(cè)序儀為ABI 3730XL。科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司，沙氏培養(yǎng)基為我科真菌室配置，電泳所需試劑購(gòu)自北京百泰克生物公司，PCR擴(kuò)增試劑(2X Taq PCR MasterMix)購(gòu)自北京天根生化科技公司，DNA marker購(gòu)自昆明豐科生物科技公司，PCR引物由昆明碩擎生物科技公司合成。

1.2 方法標(biāo)本收集后立即接種科瑪嘉顯色平皿，選擇有奶酪樣菌落生長(zhǎng)者，其中漢族患者來(lái)源84株，彝族患者來(lái)源59株，共143株。

1.2.1 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基檢測(cè)將采集到的143份樣本接種在沙氏培養(yǎng)基，36℃孵育箱中培養(yǎng)5 d(48-72 h)，轉(zhuǎn)種于科瑪嘉顯色平皿，置于30℃孵育箱中培養(yǎng)24-48 h后，觀察菌株顏色，根據(jù)顏色情況，鑒定菌種。

1.2.2 煮沸法制備DNA模板[4]取培養(yǎng)平板上的菌落到有去離子水的1.5 ml離心管中，充分懸浮菌體。置100℃沸水中煮沸10 min，10000 rpm離心5 min后取上清液1-2 μl作為PCR擴(kuò)增模板。

1.2.3 PCR擴(kuò)增目的基因片段PCR擴(kuò)增體系為25 μl，含2X Taq PCR MasterMix 12.5 μl，10 μmol/L上游、下游引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)各1.0 μl，模板DNA 1 μl(50-100 ng)。 擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火35 s,72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸7 min，4℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同。對(duì)PCR 產(chǎn)物用酒精沉淀法純化，經(jīng)Bigdye測(cè)序反應(yīng)，用ABI 3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAStar軟件分析，經(jīng)BLAST進(jìn)行序列的同源性分析，在BLAST時(shí)設(shè)置了參考菌種模式菌株(type strain)，根據(jù)99%以上符合率鑒定菌種。

2 結(jié)果

2.1 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基檢測(cè)的結(jié)果通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較，143例VVC患者來(lái)源的樣本經(jīng)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基檢測(cè)法檢測(cè)，觀察到翠綠色的白色念珠菌113株，鐵灰藍(lán)色的熱帶念珠菌1株，淡紫色的光滑念珠菌18株，粉紅色的克柔念珠菌6株(圖1b)。

圖1 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基人工判定結(jié)果

2.2 目的片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)143例VVC患者來(lái)源的念珠菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到特異性的目標(biāo)條帶，其片段大小與預(yù)期結(jié)果相一致(圖2)。

1泳道為Marker DL2000,2-7泳道分別為念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株(依次為白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌),8-12泳道為臨床樣本,blank為陰性對(duì)照。

圖2 含目的片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 測(cè)序結(jié)果分析將143份含ITS1-ITS4區(qū)段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序獲取核苷酸序列，用DNAStar軟件觀察測(cè)序獲取的峰圖(圖3)，將樣本的核苷酸序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株BLAST序列比對(duì)，同源性(相似度)在99%以上為同一個(gè)菌種。

2.4 念珠菌菌種在石屏縣漢族和彝族中的構(gòu)成測(cè)序法在VVC陰道分泌物中檢測(cè)出5種菌種，漢族與彝族檢出情況見(jiàn)表1。漢族與彝族VVC患者攜帶念珠菌的菌種分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 云南省石屏地區(qū)漢族與彝族患者VVC患者中念珠菌屬的菌種構(gòu)成

2.5 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基法與測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果比較石屏縣143例VVC患者的念珠菌樣本，通過(guò)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基法與測(cè)序法檢測(cè)，得到的菌株信息見(jiàn)表2。

表2 143例念珠菌樣本基因測(cè)序鑒定結(jié)果與顯色培養(yǎng)鑒定結(jié)果對(duì)比

3 討論

本研究采用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基法和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序法鑒定石屏縣143例VVC患者樣本中念珠菌的菌種構(gòu)成，結(jié)果提示石屏縣VVC患者的主要致病菌種是白色念珠菌，其次是光滑念珠菌，再次是近平滑念珠菌，而熱帶念珠菌、季也蒙念珠菌極少；念珠菌的菌株構(gòu)成比在石屏縣漢族和彝族患者中的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與測(cè)序法比較，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基檢測(cè)法的特異性差。

科瑪嘉顯色培養(yǎng)基法是針對(duì)常見(jiàn)的四種念珠菌在培養(yǎng)后樣本的顏色改變來(lái)確定菌種，但從已有的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)看，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基法對(duì)翠綠色為白色念珠菌，鐵灰藍(lán)色為熱帶念珠菌能準(zhǔn)確判讀，但對(duì)于粉紅色、淺紫色的光滑或克柔菌種難以鑒定。例如：光滑念珠菌的淺紫色與克柔念珠菌的粉紅色就不容易確定，即使經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)員，也不能保證百分之百的準(zhǔn)確。隨著科技進(jìn)步，多學(xué)科知識(shí)的滲透，新型檢測(cè)技術(shù)讓臨床工作中真菌鑒定難題得以迎刃而解。

圖3 為不同菌種特征性片段的測(cè)序峰圖。3a、3b、3c、3d、3e分別是光滑念珠菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、季也蒙念珠菌、近平滑念珠菌的核苷酸序列。

當(dāng)前，念珠菌菌種鑒定方法有：基因多位點(diǎn)測(cè)序分型(MLST)[5]，聯(lián)合ITS1-ITS4和D1/D2擴(kuò)增片段測(cè)序分型[6]，根據(jù)蛋白組學(xué)特征的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS[7,8])，其次是傳統(tǒng)生物學(xué)顯色鑒定包括API和科瑪嘉顯色培養(yǎng)基檢測(cè)等多種方法。已有的研究表明，從VVC患者宮頸分泌物中提取真菌DNA，PCR擴(kuò)增含ITS1-ITS2片段的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序法，是兼顧了準(zhǔn)確性、經(jīng)濟(jì)成本和可操作性的快速分子檢測(cè)方法，無(wú)論是特異性、敏感性還是時(shí)效性都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法[9]。我們的研究結(jié)果提示，石屏地區(qū)的VVC患者攜帶的致病菌仍以白色念珠菌為主，非白色念珠菌(NAC)中以光滑念珠菌為主，其他NAC也有增長(zhǎng)趨勢(shì)[2,9-15]。其與劉華等人的研究結(jié)果相一致[2,10-15]。但也有研究報(bào)道，在不同地區(qū)和人種，VVC患者的致病菌以光滑念珠菌為主[1,16,17]。

念珠菌菌種的精準(zhǔn)鑒定可以指導(dǎo)治療。白色念珠菌對(duì)大多數(shù)唑類敏感，治療首選唑類抗真菌藥[2,6]。而大多數(shù)非白色念珠菌對(duì)唑類抗真菌藥物耐藥[10,17,18]。尤其是難治性VVC、復(fù)發(fā)性VVC患者，若發(fā)現(xiàn)病原菌為NAC，應(yīng)根據(jù)體外藥敏結(jié)果適當(dāng)調(diào)整方案[2]。 因此，明確VVC患者攜帶念珠菌的菌種，有利于臨床治療用藥的合理選擇和醫(yī)療質(zhì)量的提升。本研究納入樣本量少，研究結(jié)果是否有代表性，有待于擴(kuò)大樣本來(lái)研究證實(shí)，并進(jìn)一步完成藥敏/耐藥試驗(yàn),探討不同民族致病菌株的藥敏/耐藥是否存在差異。依據(jù)每個(gè)患者分離菌株鑒定結(jié)果和體外藥敏結(jié)果，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化診治，旨在為民族聚居區(qū)衛(wèi)生管理部門制定診治策略提供重要信息。

綜上所述，云南省石屏地區(qū)的漢族及彝族VVC患者攜帶的念珠菌菌株的構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均以白色念珠菌最為常見(jiàn)。針對(duì)IIS1-ITS4基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序法能準(zhǔn)確鑒定念珠菌的菌種，而科瑪嘉顯色培養(yǎng)基檢測(cè)法缺乏特異性。