丁香酚在羅非魚體內(nèi)的代謝和休藥期研究

林麗聰，樊海平，王茂元，鐘全福，曾占壯

(福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

羅非魚(Oreochromsmossambcus)屬熱帶魚類，因富含不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，已成為我國乃至世界水產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖魚類之一[1]。我國南方地理環(huán)境及氣候有利于羅非魚的生長，而北方則不然，羅非魚養(yǎng)殖出現(xiàn)南多北少的局面。隨著經(jīng)濟(jì)的快速增長，人們對活魚需求量急劇上漲，羅非魚大多以鮮活運(yùn)輸?shù)姆绞戒N往全國各地[2]。在運(yùn)輸過程中，羅非魚應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，魚鰭堅(jiān)硬鋒利，容易被彼此刺傷。因而，為確保羅非魚的鮮活運(yùn)輸，有必要在運(yùn)輸前將其麻醉。丁香酚(Eugenol)，化學(xué)名為2-甲氧-4-丙烯基酚，分子式為C10H12O2[3]，自20世紀(jì)70年代初發(fā)現(xiàn)其對魚類有強(qiáng)烈的麻醉作用后，以其高性價(jià)比在水產(chǎn)行業(yè)被廣泛使用[4]。近年來，國內(nèi)外科研人員相繼開展了丁香酚在不同種類水產(chǎn)品中的麻醉效果研究，取得了相應(yīng)的應(yīng)用數(shù)據(jù)[5-6]。但丁香酚作為漁用麻醉劑，其安全性在國際上還存在一定的爭議。日本允許使用丁香酚為漁用麻醉劑，但規(guī)定了藥浴劑量范圍和最高殘留限量值(MRL)分別為50～200 mg/kg 和0.05 mg/kg[4，7]；美國、加拿大則因其安全性的不確定性，不允許其作為漁用麻醉劑使用[7-8]；我國相關(guān)部門對丁香酚是否可以作為漁用麻醉劑使用，暫無明確規(guī)定，但據(jù)調(diào)查顯示，我國水產(chǎn)品流通環(huán)節(jié)常使用丁香酚麻醉運(yùn)輸活魚[9]。丁香酚能有效減少羅非魚在運(yùn)輸過程中的應(yīng)激反應(yīng)，因運(yùn)輸過程長，從業(yè)人員通常采用加大劑量來維持麻醉效果[10]，但缺少休藥期意識，使銷售環(huán)節(jié)及餐桌上羅非魚中丁香酚殘留的風(fēng)險(xiǎn)增加[11]。目前國內(nèi)對于丁香酚在羅非魚體內(nèi)的藥動學(xué)研究有：韓典峰等[12]采用45 mg/L丁香酚對羅非魚進(jìn)行麻醉，在進(jìn)入完全麻醉階段后(3 min)，撈出放入清水中進(jìn)行復(fù)蘇，并研究復(fù)蘇后0～18 h羅非魚血漿中的藥代動力學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁香酚在羅非魚血漿中半衰期短，消除速率快；孫宇航等[13]采用30 mg/L丁香酚藥浴羅非魚24 h，于蘇醒后的0～96 h進(jìn)行采樣，研究羅非魚血漿、肝和肌肉中的藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明丁香酚在魚類組織中分布廣、消除慢、停留時(shí)間長。國內(nèi)雖然已對丁香酚在羅非魚體內(nèi)的藥代動力學(xué)進(jìn)行研究，但未見對相應(yīng)的休藥期進(jìn)行規(guī)定。

本試驗(yàn)針對目前羅非魚活魚普遍采用低濃度、長時(shí)間麻醉運(yùn)輸(運(yùn)輸時(shí)間一般不超過24 h)以提高存活率，降低損耗的情況，選擇既能保證麻醉效果又能保證羅非魚存活的丁香酚濃度(20 mg/L)對羅非魚進(jìn)行麻醉24 h后，間隔采樣至羅非魚血漿和肌肉中未檢出丁香酚殘留或丁香酚濃度低于最高殘留限量，并進(jìn)行藥代動力學(xué)及休藥期的研究，為丁香酚在羅非魚體內(nèi)休藥期的制訂提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚

試驗(yàn)用新吉富羅非魚，由福建省淡水水產(chǎn)研究所榕橋中試基地羅非魚商品魚養(yǎng)殖池塘撈取，平均體質(zhì)量為(250±10)g，并暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水體1 000 L的養(yǎng)殖桶中，試驗(yàn)魚經(jīng)隨機(jī)抽樣檢測無丁香酚殘留，水溫控制在(25±1)℃，每天按魚體質(zhì)量的1.5%～2%投喂羅非魚膨化飼料(福建海馬飼料有限公司生產(chǎn))，早晚各投喂1次，每次投喂后1 h排污放水25%。暫養(yǎng)及試驗(yàn)期間24 h增氧，暫養(yǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(WatersTQ-XS)；BT-Ⅱ水浴式氮吹儀(北京踏錦科技有限公司)；超純水機(jī)(美國Millipore公司)；離心機(jī)(美國Sigma公司)；旋渦振蕩器(德國IKA公司)；電子天平(德國Sartorius公司)等。

1.1.3 藥品與試劑

丁香酚原料藥(純度≥98%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，北京百靈威科技有限公司)；丁香酚-D3內(nèi)標(biāo)物(純度≥98%，美國Accustandard公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(美國Fisher公司)；正己烷為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；吐溫-80(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；肝素鈉注射液(天津生物化學(xué)制藥有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

選取體質(zhì)量為(250±10)g的健康羅非魚200尾，試驗(yàn)前2 d停止喂食。試驗(yàn)開始前0.5 h配制丁香酚溶液，將丁香酚與吐溫-80(質(zhì)量比為1∶1)混合。將配置好的丁香酚溶液倒入曝過氣的水中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，配置?0 mg/L的丁香酚溶液。另取10尾不給藥，作為空白對照組。

羅非魚以20 mg/L丁香酚溶液麻醉24 h后撈出放入清水中，分別于撈出后0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h、2 d、3 d、6 d、10 d、15 d、30 d 采集羅非魚血液(采用心臟采血)和肌肉，每個(gè)采樣點(diǎn)采10尾，每2尾一組，共5個(gè)平行。血液置于10 mL肝素鈉離心管中混勻，4 000 r·min-1離心5 min分離血漿，血漿、肌肉于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品處理及測定

血漿和肌肉樣品的前處理及測定方法參照林麗聰[2]的方法：在1.0～100.0 μg/L線性范圍內(nèi)，丁香酚在羅非魚血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1 467X-272，相關(guān)系數(shù)r=0.998 5，準(zhǔn)確度為97.0%～98.9%，精密度在1.14%～2.21%之間，定量限達(dá)到2.0 μg/L。在1.0～90.0 μg/kg線性范圍內(nèi)，丁香酚在羅非魚肌肉中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.015 4X-0.002 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，準(zhǔn)確度為90.2%～95.9%，精密度在1.91%～5.28%之間，定量限達(dá)到2.0 μg/kg。滿足羅非魚血漿和肌肉中丁香酚的殘留檢測要求。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用藥動學(xué)軟件PKS[14]處理羅非魚藥浴丁香酚后的藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)(C-T)，擬合最佳藥動學(xué)模型，推導(dǎo)藥動學(xué)參數(shù)，給出丁香酚在羅非魚體內(nèi)的代謝過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度丁香酚對羅非魚的麻醉效果

將配置好的丁香酚溶液倒入水中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，分別配置成濃度為5、10、15、20、25、30 mg/L的水體。選取體質(zhì)量為(250±10)g的羅非魚，分為6組，每組10尾魚，魚水比例控制在2∶3左右[15]，每組均設(shè)置3個(gè)平行。將6組魚分別放入不同濃度的水體中進(jìn)行藥浴麻醉24 h，結(jié)果顯示丁香酚濃度為5、10、15 mg/L的水體中，因濃度較低，羅非魚未能保持麻醉狀態(tài)，達(dá)不到長途運(yùn)輸?shù)穆樽硇Ч?；在丁香酚濃度?0 mg/L的水體中，羅非魚能保持很好的麻醉狀態(tài)，復(fù)蘇比例可達(dá)100%；而在濃度為25 mg/L及30 mg/L的水體中，因麻醉濃度偏高，羅非魚存活比例分別為20%和0%。因此，選擇既能保證麻醉效果又能保證羅非魚存活的20 mg/L為羅非魚的麻醉濃度。本研究結(jié)果同李寧等[16]研究的丁香酚濃度為10 mg/L及15 mg/L時(shí)，鱸魚只能進(jìn)入深度鎮(zhèn)靜狀態(tài)；而濃度達(dá)到20 mg/L時(shí)，鱸魚會進(jìn)入麻醉期，24 h后存活率為100%；丁香酚濃度為25～30 mg/L時(shí)，鱸魚麻醉24 h后不能全部復(fù)蘇結(jié)果相似。

2.2 丁香酚在羅非魚體內(nèi)的濃度變化及代謝動力學(xué)特征

采用20 mg/L丁香酚藥浴后，羅非魚血漿和肌肉中的藥物經(jīng)時(shí)過程均符合一級吸收一室開放模型，其理論方程分別為：C血漿=4.762(e-0.062 6 t-e-0.064 7 t)、C肌肉=1.089(e-0.006 9 t-e-0.002 17 t)。丁香酚在羅非魚體內(nèi)的濃度見表1。

表1 羅非魚藥浴丁香酚后血漿和肌肉中藥物濃度(n=5)Tab.1 Concentration of eugenol in plasma and muscle of tilapia after medicated bath(n=5)

2.3 丁香酚在羅非魚體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)

丁香酚在羅非魚體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù)見表2、藥時(shí)曲線見圖1?？梢?，丁香酚在羅非魚肌肉中藥時(shí)曲線下面積(AUC)較血漿中大，說明肌肉中丁香酚的生物利用度較高，有較多分布，但其吸收半衰期(T1/2ka)及消除半衰期(T1/2ke)顯著慢于血漿，清除率(CL/F)也偏?。槐砻鞫∠惴釉诹_非魚肌肉中消除緩慢，滯留時(shí)間較長。

表2 丁香酚在羅非魚體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of eugenol in tilapia

3 討論

3.1 麻醉溶液的配制

本研究丁香酚采用無水乙醇助溶進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)[12-13，17]，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，丁香酚溶于無水乙醇后，在水體中容易析出丁香酚油滴，羅非魚可能直接吞食油滴，平行對照試驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大于60%，結(jié)果無重復(fù)性。而采用吐溫-80為乳化劑，與丁香酚按1∶1溶解后，在水中攪拌均勻后無油滴析出，平行對照試驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，結(jié)果重復(fù)性好。因此，本試驗(yàn)選擇吐溫-80為助溶劑。

3.2 丁香酚在羅非魚中的代謝特征

以20 mg/L丁香酚溶液麻醉24 h后，羅非魚血漿中的藥-時(shí)曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，肌肉中則出現(xiàn)3個(gè)峰濃度，血漿和肌肉中丁香酚濃度均在藥浴24 h后即采樣點(diǎn)為0 h時(shí)處于峰值，峰值之后濃度迅速下降，且第二次達(dá)峰時(shí)間均為8 h，峰濃度均低于第一個(gè)峰濃度，接著血漿中丁香酚濃度逐漸下降，而肌肉中丁香酚濃度在72 h時(shí)又出現(xiàn)一個(gè)峰值。這種現(xiàn)象在劉海新等[18]進(jìn)行丁香酚在斜帶髭鯛體內(nèi)的殘留研究時(shí)也出現(xiàn)過：斜帶髭鯛經(jīng)丁香酚麻醉8 h后放入海水中復(fù)蘇，其體內(nèi)丁香酚濃度快速下降，復(fù)蘇過程血漿和組織中丁香酚也出現(xiàn)濃度反復(fù)現(xiàn)象，可能與某些臟器對藥物存在再吸收有關(guān)，如肝腸循環(huán)、胃腸循環(huán)的作用。類似情況還出現(xiàn)在凡納濱對蝦[19]中，丁香酚為苯酚共軛化合物，在動物體內(nèi)代謝過程中，容易出現(xiàn)再循環(huán)現(xiàn)象。

從表1、表2可以看出，丁香酚在血漿中的最高濃度高于肌肉，消除半衰期卻比肌肉短，說明丁香酚在羅非魚血漿中代謝較快，在肌肉中消除緩慢。李寧等[16]研究了丁香酚在大口黑鱸中的代謝殘留，將大口黑鱸放置于20 mg/L的丁香酚中麻醉24 h后，并在清水中復(fù)蘇4 d后，丁香酚才基本消除完全，說明經(jīng)長時(shí)間麻醉后，丁香酚在魚體內(nèi)容易保持長時(shí)間低濃度存在。

3.3 丁香酚在羅非魚體內(nèi)的休藥期

以日本規(guī)定的水產(chǎn)品中丁香酚最高殘留限量(MRL)為0.05 mg/kg為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)丁香酚在羅非魚血漿和肌肉中的藥物經(jīng)時(shí)過程理論方程及規(guī)定的最高殘留限量計(jì)算休藥期。在水溫(25±1)℃，羅非魚以20 mg/L丁香酚溶液麻醉24 h后，羅非魚血漿在藥浴后25.7 h即達(dá)到安全水平，而肌肉中因多次出現(xiàn)達(dá)峰現(xiàn)象，且消除緩慢，需在藥浴后270 h即約12 d后才符合規(guī)定。本研究結(jié)果同韓典峰等[12]及孫宇航等[13]的研究結(jié)果相似，即丁香酚在羅非魚血漿中半衰期短、消除速率快，在魚類組織中比在血漿中消除慢。

4 結(jié)論

在(25±1)℃水溫條件下，以20 mg/L丁香酚溶液麻醉羅非魚24 h后，休藥期至少為給藥后12 d，因休藥期太長，操作困難，為了人們的食用安全，不建議丁香酚作為羅非魚運(yùn)輸?shù)穆樽韯┦褂谩?/p>