蜂花粉微生物污染及菌群結(jié)構(gòu)分析

唐 標，羅 怡，李 銳，周秀楠，張 玲,，錢鳴蓉，戴賢君，夏效東，楊 華,

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州 310021；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

蜂花粉是蜜蜂從植物中采集花蜜后加入自身腺上分泌物和唾液后制成的呈扁圓形的團狀物，是蜜蜂蜂群主要的蛋白質(zhì)來源[1]。蜂花粉具有很高的營養(yǎng)價值，包含蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、維生素、脂類以及酶、輔酶、激素、黃酮、多肽、微量元素等多種生物活性物質(zhì)，被譽為“微型營養(yǎng)庫”[2-3]。蜂花粉中多酚類和黃酮類物質(zhì)廣泛存在，被認為是有效的抗氧化劑[4-7]。蜂花粉具有抗動脈粥樣硬化活性[8]和抗菌活性[9-10]，對心臟病、高血壓、高血脂、高血糖等心腦血管疾病具有很好的預(yù)防和改善作用，可調(diào)節(jié)人體免疫能力和神經(jīng)系統(tǒng)。因此蜂花粉作為天然營養(yǎng)保健品，其生物活性相關(guān)研究一直受到國內(nèi)外研究學(xué)者關(guān)注，也是蜂花粉產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用的重要因素[11-13]。

蜂花粉的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，但在加工生產(chǎn)過程中，存在粗放加工現(xiàn)象，可能造成蜂花粉產(chǎn)品受到微生物二次污染，進而導(dǎo)致蜂花粉產(chǎn)品質(zhì)量的下降，甚至危害消費者健康。此外，作為蜜蜂的重要營養(yǎng)來源，蜂花粉中大量微生物的存在會危害蜜蜂的生長繁殖，可能影響蜂群的生產(chǎn)能力，降低蜂產(chǎn)品的質(zhì)量，危害蜂農(nóng)的利益[14]。

蜂花粉產(chǎn)品的生產(chǎn)量及銷售量日益增長，但關(guān)于蜂花粉產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈微生物污染狀況的相關(guān)報道仍較少[15-17]。本研究收集了浙江省主要蜂花粉產(chǎn)區(qū)的代表性蜂花粉產(chǎn)品，參考國家標準對蜂花粉產(chǎn)品中細菌和真菌菌落總數(shù)進行檢測，并使用16S rDNA和ITS擴增子測序技術(shù)對茶花粉和荷花粉的細菌菌群結(jié)構(gòu)及真菌菌群結(jié)構(gòu)進行分析討論。本研究旨在較為準確地評估蜂花粉產(chǎn)品的微生物污染狀況，提升蜂花粉產(chǎn)品的質(zhì)量安全水平。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

在浙江省龍游、長興、蘭溪、江山、武義、寧波等市縣共采集107 個蜂花粉樣品，養(yǎng)蜂場購買59 份，其中17 份為現(xiàn)場新鮮采集；市場購買50 瓶。蜂花粉類型包括油菜花粉（44 份）、茶花粉（31 份）、荷花粉（11 份）、雜花粉（7 份）、伍倍子花粉（4 份）、蕎麥粉（3 份）、野玫瑰花粉（3 份）、益母草粉（3 份）、葵花粉（1 份）。

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Gel Doc凝膠成像系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；MP FastPrep-24組織研磨儀 美國MP生物醫(yī)療公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；5424R微量高速離心機 艾本德中國有限公司；Nanodrop ONE核酸定量儀 賽默飛世爾科技中國有限公司；SW-CJ-ICU超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離

稱取5 g蜂花粉樣品分別按GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》和GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》進行菌落總數(shù)、霉菌酵母總數(shù)的測定。

1.3.2 含水量檢測

稱取2～5 g蜂花粉樣品，按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中干燥法對水分含量進行檢測。

1.3.3 16 S rDNA及ITS擴增子測序

DNA抽提使用試劑盒PowerSoil DNA Isolation Kit方法進行抽提，濃度使用Nanodrop進行定量，同時通過凝膠電泳檢測。細菌的16S rDNA擴增子測序使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rDNA的V3-V4區(qū)進行擴增測序。真菌的ITS擴增子測序選用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）引物進行擴增測序。擴增子測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina MiSeq平臺，PE reads的質(zhì)控、OTU聚類分析、α多樣性和β多樣性等分析使用I-Sanger云平臺（https://www.i-sanger.com/）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗涉及的統(tǒng)計分析和相關(guān)圖形繪制使用GraphPad Prism軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉的含水量

圖1 107 份蜂花粉的水分含量Fig.1 Water contents of 107 bee pollen samples

如圖1所示，107 份蜂花粉總體的含水量在8.06%～32.92%之間。17 份在蜂場當(dāng)天收集的新鮮蜂花粉的含水量較高，在18.92%～32.92%之間，42 份經(jīng)過1～2 d晾曬后的蜂花粉含水量分布為8.06%～15.87%。在市場上流通的蜂花粉含水量主要集中在9.42%～16.86%之間。

2.2 微生物污染分析

圖2 蜂花粉的細菌菌落總數(shù)與真菌菌落總數(shù)Fig.2 Bacterial and fungal colony counts of bee pollen

如圖2所示，有8 個樣品未培養(yǎng)出可見克隆，其中兩個樣品菌落總數(shù)在2.5×105CFU/g以上，其他樣品在5×101～2.7×104CFU/g區(qū)間范圍。霉菌總數(shù)只有2 個樣品未培養(yǎng)出可見的克隆，其中兩個樣品的菌落總數(shù)在2.7×105CFU/g以上，其他樣品在5×101～6.5×104CFU/g區(qū)間范圍。從圖2A可以看出，蜂花粉中的真菌菌落總數(shù)相比細菌菌落總數(shù)較大，并且差異有顯著性。由于真菌可見培養(yǎng)的菌落絕大多數(shù)是霉菌，說明蜂花粉被污染霉菌的風(fēng)險較細菌更高。

59 份在蜂場購買的蜂花粉（含水量高于18.92%的樣品17 份與晾曬后的樣品42 份）的菌落總數(shù)進行對比。結(jié)果顯示，低含水量的蜂花粉無論是在細菌菌落總數(shù)（圖2B）上還是真菌菌落總數(shù)（圖2C）都高于高含水量的蜂花粉，差異具有顯著性。高含水量（＞18%）的蜂花粉較新鮮，直接從蜂箱外采集，可以基本排除后期加工貯運的污染；低含水量（＜17%）的蜂花粉通過晾曬、貯運等環(huán)節(jié)，增加了霉菌污染的風(fēng)險。

2.3 細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

對零售市場上購買的商品化的7 份荷花粉和5 份茶花粉樣品進行16S rDNA擴增子測序，其中1 份測序獲得reads數(shù)明顯偏低，數(shù)值沒有加入分析。根據(jù)稀釋曲線可知11 個樣本獲得的reads數(shù)量飽和（圖3A），并進行了細菌菌群結(jié)構(gòu)分析。聚類分析后，共獲得663 個無冗余的分類單元（operational taxonomic unit，OTU），可確定具有明確分類地位的屬208 個。從圖3可以看出，茶花粉與荷花粉細菌菌群多樣性結(jié)構(gòu)無顯著性差異。從科水平統(tǒng)計，藍細菌和腸桿菌占比例最大。在屬水平上，主要的細菌污染源為藍細菌、腸桿菌科類細菌及乳桿菌，其中乳桿菌也廣泛存在于蜜蜂的腸道中[18-19]。另外，可以發(fā)現(xiàn)茶花粉相比荷花粉，含有的莫拉氏菌科的細菌更豐富。該科的細菌有部分是條件致病菌，茶花粉中更豐富的原因可能是與茶花的生長環(huán)境相關(guān)，或者是采集茶花特殊的蜂群腸道中含有該類菌，在蜜蜂加工的過程中傳播到蜂花粉中。

圖3 荷花粉和茶花粉細菌菌群多樣性分析Fig.3 Diversity analysis of bacterial communities in lotus and camellia bee pollens

2.4 真菌菌落組成分析

對以上同樣的7 份茶花粉與5 份荷花粉抽提的DNA進行ITS擴增子測序，根據(jù)稀釋曲線可知測序深度已經(jīng)飽和（圖4A）。聚類分析后共獲得1 171 個無冗余OTU，可以明確分類地位的共有263 個屬。根據(jù)α多樣性分析可以發(fā)現(xiàn)真菌菌群多樣性要高于細菌。同時，兩類樣品真菌菌群組成差異極顯著，茶花粉的真菌多樣性高于荷花粉（圖4B）。

在屬水平上，unclassified_f_Davidiellaceae（未確定分類地位的，歸屬于小戴衛(wèi)霉科）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉菌屬（Penicillium）、鐮孢菌屬（Fusarium）占比例較高（圖4C）。曲霉屬、青霉菌屬、鐮孢菌屬是產(chǎn)生真菌毒素的常見菌[20]。曲霉屬可產(chǎn)生黃曲霉毒素，以黃曲霉為代表，是產(chǎn)生黃曲霉毒素的主要菌種[21]，同樣在預(yù)測的OTU中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉菌。另外，鐮孢菌屬可產(chǎn)生鐮刀菌素和伏馬毒素，青霉菌屬可以產(chǎn)生橘霉素[20]。盡管預(yù)測到了該類菌，有產(chǎn)生毒素的風(fēng)險，但是并不說明蜂花粉污染的霉菌能夠產(chǎn)生毒素；即使產(chǎn)生微量毒素，也未必能夠達到相應(yīng)的檢出限。

圖4 荷花粉和茶花粉的真菌菌群多樣性分析Fig.4 Diversity analysis of fungal communities in lotus and camellia bee pollens

圖5 荷花粉和茶花粉的真菌菌群在屬水平上的Wilcoxon秩和檢驗Fig.5 Wilcoxon rank-sum test plots of fungal community structures of lotus and camellia bee pollens at the genus level

從圖5可以看出，unclassified_f_Davidiellaceae、unclassified_p_Ascomycota、unclassified_o_Hypocreales、Zymoseptoria在茶花粉中相比在荷花粉中含量較高，差異具有顯著性；其中Zymoseptoria含量在兩者之間具有極顯著差異，Zymoseptoria同時也是重要的植物致病菌[22-23]。Wallemia、Aspergillus、Russula在荷花粉中相比茶花粉含量高，差異具有顯著性。從屬水平主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）看，這兩種花粉的真菌菌群結(jié)構(gòu)也可明顯分成兩個區(qū)域（圖6）。這些真菌的菌群差異可能是花粉來自不同的植物，與植物本身的易感真菌、生長環(huán)境（空氣、土壤、水）及后期加工運輸過程的污染等因素相關(guān)。

圖6 荷花粉和茶花粉的真菌菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上的PCoAFig.6 PCoA plot of fungal community structures of lotus and camellia bee pollen at the genus level

3 討 論

蜂花粉可以作為蜂糧，影響蜜蜂的腸道微生物[24-25]。蜜蜂對其利用會顯著提高消化道細菌總數(shù)和特異性豐度，刺激對蜜蜂有毒的糖（木糖、阿拉伯糖、甘露糖）的水解，同時產(chǎn)生的糖苷水解酶與蜜蜂自身和花粉中存在的酶有協(xié)同作用[26]。同時蜂花粉作為保健品，關(guān)系到食品安全，直接影響人的健康。蜂花粉相比蜂蜜、蜂王漿等產(chǎn)品重視程度較低，蜂花粉的藥物殘留分析研究相對較多[27-29]，但微生物污染研究極少報道。本實驗對浙江省采集的蜂花粉從上游養(yǎng)蜂場到零售環(huán)節(jié)均有涉及，對可培養(yǎng)的微生物污染進行了分析，對茶花粉及荷花粉的細菌和真菌的菌群結(jié)構(gòu)進行了研究，最后對于蜂花粉的污染概況具有了初步認識。

從研究結(jié)果看，蜂花粉的細菌污染水平小，菌群多樣性水平低，沒有發(fā)現(xiàn)常見的病原菌，例如沙門氏菌、克雷伯菌、金黃色葡萄球菌等；霉菌污染相對細菌嚴重，真菌菌群多樣性相對細菌較高，同時發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生真菌毒素的真菌含量豐富，具有食品安全風(fēng)險。通過對茶花粉與荷花粉細菌菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)兩者差異不顯著，其中藍細菌、腸桿菌科、乳桿菌含量高。據(jù)報道，乳酸菌同樣是蜜蜂腸道的主要菌群之一[30-31]。

茶花粉與荷花粉的真菌菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，unclassified_f_Davidiellaceae、unclassified_p_Ascomycota、unclassified_o_Hypocreales、Zymoseptoria在茶花粉中相比在荷花粉中含量高，差異顯著；Wallemia、Aspergillus、Russula在荷花粉中相比茶花粉含量高，具有顯著性差異。盡管預(yù)測了蜂花粉中存在產(chǎn)生真菌毒素的種屬，具有真菌毒素感染的風(fēng)險，但需要實驗進一步驗證是否能夠檢出相應(yīng)的毒素，或者毒素含量達不到檢出限。

蜂花粉的菌群多樣性或結(jié)構(gòu)較其他樣品（如糞便、土壤、河流樣品）簡單[32-35]。已有研究報道，花粉的來源影響蜂房和蜜蜂幼蟲的微生物組成[19,36-37]。蜂花粉中的微生物來源可能來源包括蜜蜂腸道菌[31]、植物花粉源微生物[38]、生長環(huán)境微生物[39]以及加工貯運環(huán)節(jié)污染的微生物，對于如何對含有的微生物溯源仍需進一步深入研究。蜂花粉類型較多，其微生物組成容易受到采集環(huán)境、貯運環(huán)節(jié)影響，單一的研究無法準確全面反映蜂花粉的污染。本實驗側(cè)重了蜂花粉中可培養(yǎng)微生物的菌落總數(shù)檢測，并作了茶花粉和荷花粉的菌群分析與比較。

4 結(jié) 論

本實驗從107 份蜂花粉中測定菌落總數(shù)和含水量，對荷花粉和茶花粉進行真菌與細菌菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)新鮮的蜂花粉含水量高于18%，但是微生物污染水平較低。以荷花粉和茶花粉為研究對象，發(fā)現(xiàn)蜂花粉的細菌菌群中藍細菌、腸桿菌科類細菌及乳桿菌較多，而真菌菌群Davidiellaceae、曲霉屬（Aspergillus）、青霉菌屬（Penicillium）和鐮孢菌屬（Fusarium）占比例較高。荷花粉與茶花粉的真菌菌群多樣性差異顯著。總體來看，蜂花粉真菌菌群多樣性高，可以產(chǎn)真菌毒素的霉菌豐富，具有食品安全風(fēng)險。本研究可為蜂花粉的安全評價提供依據(jù)。