上海市食源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子特征及耐藥性

張鵬飛，張 杰，劉心雨，付雪婷，張 萌，許學斌，吳聰明，姬 華，王 新,

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.上海市疾病預防控制中心微生物實驗室，上海 200336；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；4.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的食源性致病菌，容易造成人食物中毒和感染。其適應性強、分布范圍廣，可廣泛存在于自然界的空氣、土壤和水中，也經(jīng)常出現(xiàn)在人和動物的皮膚和黏膜[1]。研究表明，20%的人群是金黃色葡萄球菌的持續(xù)攜帶者，而30%左右的人群是間歇性攜帶者[2]，說明金黃色葡萄球菌也可通過食品操作者這一途徑污染食物。值得注意的是，除感染外，金黃色葡萄球菌還與毒素介導的食物中毒有關。人們食用被金黃色葡萄球菌污染的食品而引起嚴重的毒素介導的食物中毒，主要癥狀包括嘔吐、腹部絞痛和腹瀉，嚴重時還會出現(xiàn)頭痛，肌肉痙攣、休克等[3]。金黃色葡萄球菌分泌的毒素主要有腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）、溶血素（hemolysin）、剝脫毒素（exfoliative toxins，Ets）、中毒休克毒素-1（toxic-shock syndrome toxin-1，Tsst-1）和殺白細胞素（paton-valentine leukocidin，PVL）等[4-7]。其中SEs是引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子[4,8]。到目前為止，SEs種類有23 種，除SEA～SEE五種經(jīng)典腸毒素外，近年來還發(fā)現(xiàn)了SEG-SELX等新型腸毒素，引發(fā)食物中毒的菌株主要表達經(jīng)典腸毒素[4,8]。

近年來，隨著抗生素在醫(yī)院治療和動物養(yǎng)殖中的大量使用，病原體在抗生素選擇壓力下不斷進化，導致新的致病菌的出現(xiàn)和傳播，其中就包括“超級耐藥細菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantS.aureus，MRSA）[9]。由于MRSA菌株的超耐藥性，很快在醫(yī)院、社區(qū)和動物中流行，目前已經(jīng)成為一個重大的公共衛(wèi)生問題。值得注意的是，MRSA已存在于多種食物中，尤其是食用動物及其產(chǎn)品[10-13]。研究表明，屠宰攜帶MRSA的動物以及感染MRSA的人員處理食品時都會造成食物的污染[14-16]。這些耐藥細菌可通過各種途徑從食品來源轉(zhuǎn)移到人類，假如食物可作為人感染MRSA的重要儲庫和來源，這將對人類健康造成巨大威脅。

葡萄球菌染色體基因盒mec（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）分型、葡萄球菌A蛋白（Staphylococcusprotein A，spa）分型和多位點序列（multilocus sequence typing，MLST）分型是S.aureus的3 種常用分型方法。mec基因位于可移動元件SCCmec上，且不同的MRSA菌株的SCCmec型別存在較大差異。目前有12 種分型被發(fā)現(xiàn)（I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI和XII型）[17]。如醫(yī)院感染MRSA（hospital-associated MRSA，HA-MRSA）菌株多為I型、II型和III型，由于其除攜帶mecA基因外還帶有其他耐藥基因，因此該類型MRSA普遍具有多重耐藥特點；而社區(qū)獲得性MRSA（community-associated MRSA，CA-MRSA）菌株多為IV型、V型和VII型和動物源MRSA（livestockassociated MRSA，LA-MRSA）多為IV和V型[17]。綜合spa、MLST和SCCmec分型發(fā)現(xiàn)，LA-MRSA的主要型別為ST398-IV/V-t011/t034和ST9-IV/V-t899，其中ST398-IV/V-t011/t034分子型主要分布于歐洲和北美洲和ST9-IV/V-t899分子型主要分布于亞洲；HA-MRSA的主要型別為ST5-II-t002和ST239-III-t030/t037；CA-MRSA的主要型別為ST1-IV-t127和ST59-IV/V-t437[18]。因此SCCmec分型、spa分型和MLST分型既可作為探討MRSA在人-畜-食品傳播途徑的重要依據(jù)，也是MRSA進行流行病學調(diào)查研究的重要工具。

本研究以上海市連續(xù)6 a分離到的食源性金黃色葡萄球菌為研究對象，了解上海市MRSA在不同種類食品中的流行情況以及菌株的耐藥性和分子特征。進而判斷MRSA易污染的食品以及可能的污染源，旨在為有效預防MRSA在食品中的污染，也為臨床治療時科學、合理地選用抗菌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株來自上海市疾病預防控制中心2011—2016年分離到的184 株食源性金黃色葡萄球菌。其中，4 株來源于雞蛋，2 株來源于焙烤食品，11 株來源于海鮮，16 株來源于涼拌菜，121 株來源于生肉制品，11 株來源于熟肉制品，4 株來源于熟制米面制品和15 株食源性金黃色葡萄球菌來源暫不清楚。全部菌株通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）對耐熱核酸酶基因（nuc）擴增鑒定為金黃色葡萄球菌。此外，耐藥性質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213和大腸桿菌ATCC 25922。所有的菌株貯存在－80 ℃冰箱直至使用。

Mueller Hinton（MH）瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB） 北京陸橋技術有限責任公司；抗生素北京索萊寶科技有限公司；溶葡萄球菌素 美國Sigma公司；Taq酶、Buffer（Mg2＋）、dNTP、MgCl2大連寶生物（TaKaRa）公司；DNA提取試劑盒 杭州博日科技有限公司；引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

將凍存管菌株活化在TSA平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于5 mL的TSB培養(yǎng)基，放置搖床37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。然后根據(jù)Biospin細菌DNA抽提試劑盒說明書進行操作。最后將抽提的細菌基因組DNA模板放置在－40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MRSA菌株鑒定

參考Wang Xin等[10]的方法，采用PCR方法對金黃色葡萄球菌DNA模板進行mecA基因擴增，檢測為mecA陽性的菌株，即為MRSA菌株。

1.2.3 耐藥性檢測

根據(jù)臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI）推薦的瓊脂稀釋法對食源性MRSA菌株進行15 種常用抗生素的最低抑菌濃度測定，具體藥物為青霉素（penicillin，PEN）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、苯唑西林（oxacillin，OXA）、紅霉素（erythromycin，ERY）、四環(huán)素（tetracyclines，TET）、頭孢西?。╟efoxitin，F(xiàn)OX）、頭孢哌酮（cefoperazone，F(xiàn)OP）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、慶大霉素（chloramphenicol，GEN）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、利福平（rifampin，RIF）、萬古霉素（vancomycin，VAN）、阿米卡星（amikacin，AMK）、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（trimethoprim/sulfamethoxazole，T/S）、阿莫西林/克拉維酸（amoxicillin/clavulanic acid，A/C）。用藥最低抑菌濃度見表1。

表1 藥敏測定抗生素及耐藥折點Table 1Drug-resistance breakpoints of antibiotics tested in this study

1.2.4 毒素基因檢測

參考Wang Xin等[10]的方法，采用PCR方法對所有的食源性MRSA菌株進行27 種毒素基因檢測，包括5 種經(jīng)典腸毒素基因（sea、seb、sec、sed和see），16 種新型腸毒素基因（seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser、ses、set、seu和sev），4 種溶血素基因（hla、hlb、hld和hlg），殺白細胞毒素基因（pvl），中毒休克綜合征毒素基因（tsst-1）。

1.2.5 分子分型

1.2.5.1 spa分型

spa分型是根據(jù)金黃色葡萄球菌蛋白A的X區(qū)存在可變的24 bp重復序列建立的基因分型方法。參照spa分型數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://www.spaserver.ridom.de/）推薦的方法進行引物設計和PCR擴增，首先運用PCR方法對spa基因進行擴增和測序。將測序結(jié)果提交到該網(wǎng)站，獲得菌株的spa型別。spa基因擴增和測序引物從該網(wǎng)站獲得：spa-1113f（5’-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3’）、spa-1514r（5’-CAGTAGTG CCGTTTGCTT-3’），并由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2.5.2 MLST分型

參照MLST數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://www.mlst.net/）推薦的方法進行引物設計和PCR擴增。首先通過PCR方法對7 個管家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL）進行擴增和測序。將測序結(jié)果上傳到該網(wǎng)站進行比對，獲取具體ST型別。

1.2.5.3 SCCmec分型

參照Zhang Kunyan等[19]的方法，采用多重PCR法測定SCCmec的類型，并將PCR產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，根據(jù)擴增條帶大小判斷MRSA菌株的SCCmec型別。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

按CLSI 2014標準進行耐藥性判斷，所有數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并運用Word 2003進行三線表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRSA檢出情況

運用PCR方法對184 株食源性金黃色葡萄球菌進行mecA基因檢測，共檢測到9 株mecA陽性菌株，檢出率為4.9%（9/184）（表2）。其中，1 株來源于雞蛋樣本，占該樣本菌株的25.0%（1/4）；1 株來源于涼拌菜樣本，占該樣本菌株的6.3%（1/16）；3 株來源于生肉制品，占該樣本菌株的2.6%（3/115）；4 株來源于熟肉制品，占該樣本菌株的23.5%（4/17）。說明MRSA菌株主要污染食源性動物制品和手工食品。

表2 MRSA分離情況Table 2 Isolation of MRSA

2.2 MRSA菌株耐藥情況

表3 MRSA菌株的耐藥性及分子特性Table 3 Antimicrobial susceptibility and molecular characteristics of MRSA isolates

如表3所示，所有的MRSA菌株都表現(xiàn)為多重耐藥，至少耐受3 種不同類型的抗生素。其中，對AMP和PEN的耐藥最為普遍，耐藥率達100.0%（9/9），其次對FOX和T/S的耐藥率為88.9%（8/9），對ERY耐藥率為55.6%（5/9），對A/C耐藥率為33.3%（3/9），對TET和OXA的耐藥率為22.2%（2/9）和對CIP的耐藥率為11.1%（1/9）。所有MRSA菌株均對FOP、CHL、RIF、VAN、AMK和GEN敏感。在本研究中9 株MRSA菌株共有8 種不同的耐藥譜，其中最常見的耐藥譜是AMP-FOX-T/S-PEN，檢出率為22.2%（2/9）。

2.3 分子分型

2.3.1 spa分型

對9 株MRSA菌株進行spa基因擴增，測序并進行數(shù)據(jù)比對分析，結(jié)果如表3所示。所有的MRSA菌株共有6 種分型。其中主導的spa型為t437 33.3%（3/9），其次為t14340 22.2%（2/9），t002、t034、t4549和t10738均為11.1%（1/9）。

2.3.2 MLST分型

對9 株MRSA菌株的7 個管家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL）進行擴增，測序并進行數(shù)據(jù)比對分析，結(jié)果如表3所示。所有的MRSA菌株共有6 種ST型，其中檢出最高的為ST59 33.3%（3/9），其次為ST88 22.2%（2/9），ST4495、ST630、ST398和ST5均為11.1%（1/9）。

2.3.3 SCCmec分型

為了進一步了解MRSA菌株的分子流行病學，對所有的MRSA菌株進行SCCmec分型，結(jié)果如表3所示。9 株MRSA菌株共有8 株菌被分型，共有3 種分型，分別為II、III和IVa型。其中檢出最高的為IVa型44.4%（4/9），其次為III型33.3%（3/9）和II型11.1%（1/9）。

2.4 MRSA菌株毒素基因攜帶情況

表4 毒素基因檢出結(jié)果Table 4 Results of detection of enterotoxin genes

對27 種毒素基因進行檢測，結(jié)果如表4所示，所有菌株至少攜帶1 種毒素基因，包括seb、seg、sei、sem、sen、seo、sep、seq、hla、hlb、hld和pvl基因。其中2 個溶血素基因（hla和hld）和殺白細胞素基因（pvl）的攜帶率最高為100.0%（9/9），其次為hlb66.7%（6/9），seg33.3%（3/9），sep和seq均為22.2%（2/9），seb、sei、sem、sen和seo均為11.1%（1/9），此外13 個腸毒素基因（sea、sec、sed、see、seh、sej、sek、sel、ser、ses、set、seu和sev），溶血素hlg基因和中毒休克綜合征毒素基因（tsst-1）沒有檢出。從27 種毒素基因的攜帶情況看，菌株攜帶殺白細胞素基因（pvl）和溶血素基因的比率較高，所占比例分別為20.0%（9/45）和53.3%（9/45）。在本研究中9 株MRSA菌株共有7 種不同的毒素基因譜，每株菌株攜帶4～8 種毒素基因不等，其中最常見的基因譜sep-hla-hlb-hld-pvl和hla-hlb-hld-pvl均為22.2%（2/9）。

3 討 論

近年來，由于MRSA不僅對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，同時還對非β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)耐受，迅速成為污染食品的病原菌之一[20-21]。但目前，對同一地區(qū)不同種類的食品，進行連續(xù)多年的跟蹤調(diào)查鮮有報道。在本研究中，食源性MRSA的分離率較低（4.9%，9/184），其中MRSA主要分離自熟肉制品（44.4%，4/9）和生肉制品（33.3%，3/9），其次為雞蛋和涼拌菜（均為11.1%，1/9），而在糕點、海鮮和熟制米面制品中均無檢出。該結(jié)果與Weese[11]、Wang Xin[12]和Normanno[22]等報道的食源性動物產(chǎn)品及其制品中MRSA的污染率比較一致，表明國內(nèi)外食源性MRSA均處于較低水平的流行。但也不排除由于食源性動物產(chǎn)品及其制品樣本較大，造成MRSA菌株檢出較多的可能。在中國，人們更傾向食用加熱處理后的食品，眾所周知對食品進行加熱處理可以殺死其中的細菌，但本研究在熟肉制品MRSA的檢出率最高，說明動物產(chǎn)品及其制品是MRSA傳播到人的一個主要儲庫。

在本研究中，所有的MRSA菌株都表現(xiàn)為多重耐藥，都至少耐受3 種抗生素。該結(jié)果較Wang Xin[10]和Fessler[13]等報道的食源性MRSA菌株的耐藥性弱一些。在本研究中，食源性MRSA菌株除對ERY和T/S抗生素耐受外，對非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物幾乎都不耐受，造成這一結(jié)果的原因可能是由于不同地區(qū)抗生素的使用情況存在差異，導致不同耐藥表型菌株的出現(xiàn)[23]。本研究所有的食源性MRSA菌株均對VAN敏感，說明糖肽類抗生素仍然是治療MRSA最有效的藥物。值得注意的是，在本研究中存在較多的食源性MRSA菌株（77.8%，7/9）對OXA敏感而對FOX耐藥。這與其他研究報道[24-26]一致，在醫(yī)院和食品中也分離到OXA敏感而對FOX耐藥的MRSA菌株?，F(xiàn)已將OXA敏感-FOX耐藥-mecA陽性的金黃色葡萄球菌定義為OS-MRSA菌株（oxacillin-susceptiblemecA-positiveS.aureus，OS-MRSA）[27]。最近有文獻報道[27]，在OS-MRSA菌株中，mecA基因的表達受bla系統(tǒng)（blaI-blaR1-blaZ）調(diào)控，bla系統(tǒng)的缺失或者突變會影響mecA基因的表達，從而影響MRSA菌株的耐藥表型。因此，只通過菌株耐藥表型定義MRSA，很容易造成MRSA菌株的漏檢。由于mecA基因的存在，在抗生素的壓力下易引發(fā)超耐藥MRSA變異菌株的出現(xiàn)[27]。所以，需要進一步關注OS-MRSA菌株在食品中的污染情況，及其是否通過食物鏈進行傳播。

在本研究中，MRSA菌株對腸毒素基因的攜帶率較低，只攜帶seb、seg、sei、sem、sen、seo、sep和seq腸毒素基因，且只分布在生肉和熟肉制品的樣本中，這與之前報道的MRSA菌株較少攜帶腸毒素基因的研結(jié)果一致[10,28]。本研究ST5型菌株攜帶完整的egc（seg、sei、sem、sen和seo）基因簇基因，且具有較高的耐藥性，是否存在毒素基因隨著耐藥基因轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)移，需要引起關注。關于毒素基因的轉(zhuǎn)移研究還不夠深入，還需要進一步研究。除此之外，所有的食源性MRSA菌株均攜帶溶血素基因，其中hla和hld基因攜帶率為100.0%（9/9），hlb也有較高的攜帶率（77.8%，7/9）。溶血素是金黃色葡萄球菌分泌的一種強致病性毒素因子，主要作用于宿主的細胞膜并對其造成損傷，也能破壞血小板，從而造成機體失血[29]。目前金黃色葡萄球菌溶血素已經(jīng)被納入評價疾病的流行及嚴重程度的標準[30]。值得注意的是，有報道稱金黃色葡萄球菌感染患者在治療過程中，隨著在CIP等抗菌藥物的壓力及患者免疫系統(tǒng)降低的條件下，β-溶血素的表達增多，進而加重患者的病情[31-32]。雖然溶血素致病機制的研究還存在爭議，但不能忽視其在抗生素壓力下會進一步促進溶血素的表達，嚴重威脅著人體健康。對于其他毒素因子如殺白細胞素pvl基因在MRSA菌株中均有檢出，已經(jīng)有大量的研究表明pvl基因主要發(fā)現(xiàn)與CAMRSA菌株中，可以導致壞死性肺炎，降低患者的存活率[33-34]。由此說明，可能存在社區(qū)型MRSA對食品的污染，這要求相關從業(yè)人員注意規(guī)范操作及售賣環(huán)境的清潔，同時確保相關操作人員的定期健康體檢。

本研究共檢測出6 種分子型，主要為ST59-IVa-t437（33.3%，3/9）和ST88-III-t14340（22.2%，2/9），其次為ST398-IVa-t034、ST630-III-t4549、ST5-II-t002和ST4495-t10738（11.1%，1/9）。所有分離自生肉制品的MRSA克隆型均為ST59-IVa-t437。此外，根據(jù)現(xiàn)有報道ST59-IVa-t437屬于CA-MRSA[35-36]，表明應加強對MRSA菌株相互傳播的關注。在本研究熟肉制品中分離到2 株攜帶pvl基因的ST88-III-t14340型菌株，楊永剛[37]報道該菌株主要發(fā)現(xiàn)于醫(yī)院，且具有較強的致病性。目前，關于該類菌株鮮有報道，但其造成的感染不容忽視。此外，在生肉制品中還分離到1 株ST398-IVa-t034型菌株，ST398 MRSA主要對家畜造成感染，而感染人類的ST398菌株和受污染的ST398食品通常對甲氧西林敏感[38-39]，這與本研究結(jié)果存在明顯差異，對該類菌株的研究應進一步深入。在熟肉制品中還分離到1 株ST5-II-t002型菌株，該譜系菌株主要定植于醫(yī)院和社區(qū)[40-41]，很少有污染食物的報道，但其超耐藥和攜帶較多的毒素基因，一旦在醫(yī)院和食物之間相互傳播，將會給醫(yī)院治療和人體健康造成巨大威脅。另外，在涼拌菜中分離到的1 株ST630 MRSA菌株，該譜系菌株在中國已被廣泛報道[42-43]。相比之下，其他國家對ST630 MRSA菌株的報道較少，這可能是由于不同區(qū)域飲食結(jié)構不同造成。綜上結(jié)果表明，上海市食源性MRSA不僅譜系豐富，而且較多譜系與動物源、社區(qū)和醫(yī)院MRSA相關。因此，不能忽視MRSA菌株通過養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、食品制作者或者食品加工環(huán)節(jié)傳播給食物的可能，需要防范MRSA菌株的傳播。

本研究結(jié)果說明，上海市食源性MRSA污染率較低，其主要污染食源性動物制品及手工食品。此外，分離到的MRSA菌株具有耐藥性強，譜系豐富，很多與動物源、醫(yī)院和社區(qū)流行譜系相同，且所有的菌株均攜帶pvl基因，綜上數(shù)據(jù)表明動物養(yǎng)殖環(huán)境以及在食品加工過程中都有可能造成MRSA污染到食品中。因此，不僅要嚴格控制抗生素的使用，還應規(guī)范食品加工操作、提升食品加工技術以及改善售賣環(huán)境，這些都是預防MRSA污染與傳播的關鍵環(huán)節(jié)。