金 嫻 譚 萍 樊春卉 朱平安 黃曉彤 張艮芳 陳 芳

(廣東省深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院1 檢驗(yàn)科,2 婦產(chǎn)科,深圳市 518081，電子郵箱：514968029@qq.com)

B族鏈球菌(Group BStreptococcus,GBS)也稱無(wú)乳鏈球菌，是導(dǎo)致圍生期感染的重要病原菌。在妊娠晚期，孕婦感染GBS后可導(dǎo)致胎膜早破、流產(chǎn)、絨毛膜羊膜炎、胎兒先天性肺炎及宮內(nèi)死胎等；而新生兒發(fā)生GBS 侵襲性感染可導(dǎo)致重癥肺炎、敗血癥和化膿性腦膜炎等，對(duì)孕產(chǎn)婦及新生兒造成嚴(yán)重后果[1]。目前，全球范圍內(nèi)GBS的檢出率因地區(qū)、種族差異及檢測(cè)方法不一而存在較大差異，其檢出率在5%～30%之間[2-4]。采用直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)GBS已得到廣泛開(kāi)展，但是其檢出率低，極易出現(xiàn)漏檢。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告，選擇性的肉湯增菌能提高GBS的陽(yáng)性檢出率[5]，而免疫層析法、PCR法可快速檢測(cè)GBS，且檢出率相對(duì)較高[4-5]。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦的檢測(cè)方法是先對(duì)樣本進(jìn)行增菌，再進(jìn)行再次培養(yǎng)或者抗原、核酸檢測(cè)[6]。但在實(shí)際工作中，對(duì)樣本增菌后再進(jìn)行抗原及核酸檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高，因此很少采用該方法。本研究結(jié)合本院GBS檢測(cè)開(kāi)展情況及相關(guān)文獻(xiàn)，比較采用不同方法進(jìn)行直接檢測(cè)及增菌后檢測(cè)的檢測(cè)效果，為臨床GBS檢測(cè)需求提供合理的方案。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年4月至2019年1月在我院產(chǎn)檢的300例孕婦作為研究對(duì)象，年齡22～39歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：妊娠35～37周。排除1周內(nèi)使用過(guò)抗菌藥或陰道周圍外用清洗劑的孕婦，以及合并嚴(yán)重心血管、肝、腎及免疫系統(tǒng)疾病的孕婦及病歷資料不全者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有孕婦均知情同意。

1.2 儀器與試劑 儀器：法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK2 Compact細(xì)菌檢定儀，日本松下公司生產(chǎn)的MCO-18ACx型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的VIIA 7DX型全自動(dòng)熒光定量PCR儀。試劑：青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Todd-Hewitt肉湯(Todd-Hewitt Broth,THB)培養(yǎng)基(批號(hào)：20171211)、萘啶酮酸(批號(hào)：20171028、20180320)、多粘菌素E(批號(hào)：20180221)，鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的血平板(批號(hào)：20180308B、20180606B、20180905B)；中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的GBS核酸檢測(cè)試劑盒及陰、陽(yáng)對(duì)照試劑盒(批號(hào)：2018001)；北京金沃夫生物工程科技有限公司生產(chǎn)的GBS免疫層析法檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20170801)。

1.3 標(biāo)本采集 先擦去外陰分泌物，將無(wú)菌陰道拭子小心插入陰道內(nèi)，在陰道下段1/3處旋轉(zhuǎn)1周采集陰道分泌物，之后將同一根拭子插入肛門(mén)，在肛門(mén)括約肌上緣2～3 cm 處輕輕旋轉(zhuǎn)取得直腸分泌物，共采集4根陰道-直腸分泌物樣本。標(biāo)本采集完成后1 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。將1根置于THB培養(yǎng)基，35℃、5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)增菌培養(yǎng)，另3根用于直接檢測(cè)。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)方法 (1)直接培養(yǎng)：取1根樣本采用三區(qū)劃線法接種于1個(gè)血平板，在35℃、5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，若細(xì)菌生長(zhǎng)不良則繼續(xù)培養(yǎng)至36～48 h。(2)改良培養(yǎng)法：增菌培養(yǎng)18～24 h、36～48 h后，用無(wú)菌吸管各取1滴增菌液滴加入血平板上，用三區(qū)劃線法接種。接種后的血平板，在35℃、5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。(3)結(jié)果判定：在血平板上可疑GBS菌落為灰白色，外表光滑凸起，具有透光性；對(duì)可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，革蘭染色陽(yáng)性，鏡下呈鏈狀排列，觸酶試驗(yàn)陰性，協(xié)同溶血試驗(yàn)陽(yáng)性，再采用細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行檢測(cè)以確認(rèn)。選取梅里埃公司提供的質(zhì)控菌株無(wú)乳鏈球菌ATCC13813和化膿鏈球菌ATCC19615分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.5 免疫層析法 (1)直接免疫層析法：在抽提管內(nèi)加入試劑A和試劑B各5滴，將1根樣本拭子插入抽提管中，反復(fù)用力旋轉(zhuǎn)并上下抽提至少10次，靜置10 min，棄去拭子，塞緊滴頭，滴加2～3滴樣本液至試劑卡加樣孔中，10～20 min判斷結(jié)果。(2)改良免疫層析法：增菌培養(yǎng)18～24 h、36～48 h后，用無(wú)菌吸管各取1 mL增菌液，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入試劑A和試劑B各5滴，混勻后靜置10 min，滴加2～3滴樣本液至試劑卡加樣孔中，10～20 min判斷結(jié)果。(3)判斷標(biāo)準(zhǔn)：質(zhì)控線(C)及檢測(cè)線(T)均出現(xiàn)紅色線條判斷為陽(yáng)性，只有質(zhì)控線出現(xiàn)紅色線條判定為陰性，只有檢測(cè)線出現(xiàn)紅色線條判定為無(wú)效。

1.6 PCR法 (1)直接PCR法：取1根樣本拭子并向其中加入1 mL生理鹽水，振蕩混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DNA提取液50 μL，100℃裂解10 min，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，取上清5 μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并判定結(jié)果。(2)改良PCR法：增菌培養(yǎng)18～24 h、36～48 h后，用無(wú)菌吸管各取1 mL增菌液[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min后棄上清，加入DNA提取液50 μL，100℃裂解10 min，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，取上清5 μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并判定結(jié)果。(3)判斷標(biāo)準(zhǔn)：FAM通道有擴(kuò)增曲線且CT值<38判定為陽(yáng)性；FAM通道有擴(kuò)增曲線且CT值≥38或者FAM通道無(wú)擴(kuò)增曲線且VIC通道有擴(kuò)增曲線判定為陰性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，同一患者樣本直接與改良方法的比較使用McNemar檢驗(yàn)，細(xì)菌培養(yǎng)法、PCR法、層析法之間比較，采用行×列表χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于樣本率的兩兩比較，采用Bonferroni法對(duì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行校正，校正后的兩兩比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.017。

2 結(jié) 果

2.1 直接細(xì)菌培養(yǎng)與增菌后培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果 直接細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出率為2.33%(7/300)，增菌18～24 h、36～48 h后培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率分別為9.33%(28/300)、10.67%(32/300)。增菌18～24 h、36～48 h后培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率高于直接培養(yǎng)(均P<0.001)，但增菌不同時(shí)間后培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.125)，見(jiàn)表1、表2及表3。

表1 直接培養(yǎng)法與增菌18～24 h后細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

表2 直接培養(yǎng)法與增菌36～48 h后細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

表3 增菌18～24 h與36～48 h后細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

2.2 直接PCR法與增菌后PCR法的檢測(cè)結(jié)果 直接PCR法陽(yáng)性檢出率為9.00%(27/300)，增菌18～24 h、36～48 h后PCR法陽(yáng)性檢出率分別為12.67%(38/300)、14.00%(42/300)。增菌18～24 h、36～48 h后PCR法陽(yáng)性檢出率均高于直接PCR法(均P<0.001)，但增菌不同時(shí)間后PCR法的陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.289)，見(jiàn)表4、表5及表6。

表4 直接PCR法與增菌18～24 h后PCR法的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

表5 直接PCR法與增菌36～48 h后PCR法的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

表6 增菌18～24 h與36～48 h后PCR法的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

2.3 直接免疫層析法與增菌后免疫層析法的檢測(cè)結(jié)果 直接免疫層析法陽(yáng)性檢出率為5.33%(16/300)，增菌18～24 h、36～48 h后免疫層析法陽(yáng)性檢出率為13.67%(41/300)、14.67%(44/300)。增菌18～24 h、36～48 h后免疫層析法陽(yáng)性檢出率均高于直接免疫層析法(均P<0.001)，但增菌不同時(shí)間后免疫層析法的陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.250)，見(jiàn)表7、表8及表9。

表7 直接免疫層析法與增菌18～24 h后免疫層析法的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

表8 直接免疫層析法與增菌36～48 h后免疫層析法的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

表9 增菌18～24 h與36～48 h后免疫層析法的檢測(cè)結(jié)果比較(n)

2.4 3種直接檢測(cè)法結(jié)果的比較 3種直接檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中直接PCR法的陽(yáng)性檢出率高于直接細(xì)菌培養(yǎng)法(P<0.017)，其他方法兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.017)，見(jiàn)表10。

表10 3種直接檢測(cè)法結(jié)果的比較[n(%)]

2.5 增菌18～24 h后3種檢測(cè)法結(jié)果的比較 增菌18～24 h后3種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表11。

表11 增菌18～24 h后3種檢測(cè)法結(jié)果的比較[n(%)]

3 討 論

GBS感染是臨床發(fā)生率較高的妊娠晚期疾病，已被證實(shí)是引起新生兒疾病和死亡的主要原因。妊娠期的臨床篩查是預(yù)防GBS感染的有效途徑[7-9]。美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心自1996年至今共發(fā)布了3版妊娠期GBS篩查指南，我國(guó)在2010年開(kāi)始發(fā)布妊娠期GBS篩查指南，指南中的直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法由于對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高、容易開(kāi)展，被廣泛應(yīng)用于各醫(yī)院[10]。但是已有文獻(xiàn)表明，直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出率不高，容易出現(xiàn)臨床漏檢[11-12]。而采取先接種選擇性肉湯培養(yǎng)基再轉(zhuǎn)種血平板的方法，由于耗時(shí)長(zhǎng)許多醫(yī)院不愿意使用，但是較多研究表明增菌后細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率更高[13-15]。本研究結(jié)果顯示，增菌后，無(wú)論是細(xì)菌培養(yǎng)法、免疫層析法還是PCR法均能獲得比直接檢測(cè)更高的陽(yáng)性檢出率(均P<0.05)，與上述結(jié)果相似。這提示使用選擇性肉湯培養(yǎng)基增菌后，確實(shí)能夠獲得更高的陽(yáng)性檢出率。分析主要原因可能是直接培養(yǎng)法中菌種豐富，雜菌的生長(zhǎng)覆蓋GBS的生長(zhǎng)，加大了檢測(cè)難度[16]；其次是標(biāo)本本身的GBS含量較低，檢測(cè)方法靈敏度較低則會(huì)造成漏檢，而選擇性肉湯培養(yǎng)基中包含有萘啶酸、多黏菌素等抗菌藥，能夠有效抑制受檢者陰道-直腸樣本中非目標(biāo)菌種(多數(shù)為革蘭陰性菌)的生長(zhǎng)，雖然對(duì)GBS也會(huì)產(chǎn)生輕度抑制作用，但選擇性肉湯培養(yǎng)基中的鏈球菌生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)成分可同時(shí)有助GBS的生長(zhǎng)，更利于檢出。在增菌的過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)有的樣本增菌18～24 h后菌液仍清亮，為避免漏檢，我們延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至36～48 h，然而增菌36～48 h后細(xì)菌培養(yǎng)法、免疫層析法及PCR法的陽(yáng)性檢出率提高并不顯著。因此，為了縮短檢測(cè)時(shí)限、及時(shí)發(fā)出報(bào)告，增菌的時(shí)間在18～24 h為宜，沒(méi)有必要延長(zhǎng)增菌時(shí)間。但由于樣本量較少，本研究結(jié)果也可能存在偏倚，需要加大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，目前市場(chǎng)上已有商品化的GBS增菌培養(yǎng)基，但其價(jià)格較為昂貴，與目前大力提倡的降低醫(yī)用耗材占比的管理目標(biāo)不相符；而自行配制分裝的增菌培養(yǎng)基方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且增菌質(zhì)量有保證，能很好地提高GBS的陽(yáng)性檢出率。因此，筆者認(rèn)為有必要將選擇性肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行增菌18～24 h作為GBS檢測(cè)的常規(guī)步驟。

細(xì)菌培養(yǎng)法、免疫層析法及PCR法直接檢測(cè)樣本GBS的陽(yáng)性率分別為2.33%、5.33%、9.00%，其中PCR法的陽(yáng)性檢出率高于細(xì)菌培養(yǎng)法(P<0.017)。這是因?yàn)镻CR法可以忽略細(xì)菌培養(yǎng)法中GBS生長(zhǎng)的情況，而且能夠檢出非β型溶血性GBS及協(xié)同溶血試驗(yàn)陰性的GBS[17]。在細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定的過(guò)程中，只有可疑的菌落才有機(jī)會(huì)被挑取行協(xié)同溶血試驗(yàn)及下一步的鑒定，對(duì)可疑菌落的選擇及對(duì)平板的判讀要求微生物工作者有較高的專業(yè)能力，這也是細(xì)菌培養(yǎng)容易造成漏檢的原因之一。而對(duì)樣本進(jìn)行增菌18～24 h后,細(xì)菌培養(yǎng)法、免疫層析法及PCR法對(duì)GBS的陽(yáng)性檢出率分別為9.33%、13.67%、12.67%，三者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這可能是因?yàn)?，增菌后GBS菌量增加，當(dāng)待測(cè)樣本中的GBS顯著增加，超過(guò)各方法的檢測(cè)靈敏度之后，各檢測(cè)方法因靈敏度不同造成的檢測(cè)差異即縮小，最終導(dǎo)致三種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率相似。

細(xì)菌培養(yǎng)法、免疫層析法及PCR法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。細(xì)菌培養(yǎng)法檢出率相對(duì)較低且對(duì)工作人員的專業(yè)能力要求較高，但因其可以進(jìn)一步做藥敏試驗(yàn)而被廣泛應(yīng)用，通過(guò)增菌可以顯著提高細(xì)菌培養(yǎng)法的陽(yáng)性檢出率，因此筆者認(rèn)為增菌步驟對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)法很重要。PCR法靈敏度更高，只需2～3 h即可完成批量檢測(cè)，但操作相對(duì)復(fù)雜，且對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)施及場(chǎng)地要求較高，在不具備開(kāi)展基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)院無(wú)法完成。而免疫層析法雖然檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，但檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，30 min左右即可完成，且僅需試劑盒及一些簡(jiǎn)單的試驗(yàn)設(shè)備，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行改良即檢測(cè)前對(duì)樣本進(jìn)行增菌，檢測(cè)時(shí)對(duì)增菌液進(jìn)行濃縮，能獲得與PCR法相似的陽(yáng)性檢出率。

綜上所述，檢測(cè)前增菌18～24 h均能提高細(xì)菌培養(yǎng)法、免疫層析法、PCR法對(duì)GBS的陽(yáng)性檢出率，且前兩種方法可獲得與PCR法相似的陽(yáng)性檢出率。此外，檢測(cè)時(shí)對(duì)增菌液進(jìn)行濃縮，能進(jìn)一步提高免疫層析法對(duì)GBS的陽(yáng)性檢出率，值得臨床推廣應(yīng)用，尤其是專業(yè)人員專業(yè)能力及設(shè)備相對(duì)薄弱的基層實(shí)驗(yàn)室。