賈俊強(qiáng)，孫晟源，周曉瑞，繆 楠，朱玉杰，吳瓊英,

（1.江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212004；2.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

膠原蛋白是生物體中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，目前已知有I、II型和III型等28 種膠原蛋白，主要存在于動(dòng)物的皮、骨和肌腱等結(jié)締組織中，其中I型膠原蛋白具有弱的抗原性、良好的生物相容性和降解性，廣泛用于食品添加劑、生物醫(yī)學(xué)材料、醫(yī)學(xué)組織工程等領(lǐng)域[1-2]。目前生產(chǎn)的膠原蛋白制品主要來源于豬、牛和雞等陸生動(dòng)物，但因受瘋牛病、口蹄疫和禽流感等流行病的影響限制了陸生動(dòng)物膠原蛋白的應(yīng)用[3]。與陸生動(dòng)物膠原蛋白相比，魚類膠原蛋白在生物安全性上具有更大的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注[4]。我國(guó)是世界漁業(yè)大國(guó)，魚加工過程中產(chǎn)生的大量廢棄物中均富含膠原蛋白，其中，魚皮中粗膠原蛋白約占80%，且魚皮中膠原蛋白以I型膠原為主[5-6]，具有良好的應(yīng)用前景。因此，關(guān)于魚源膠原蛋白資源開發(fā)與應(yīng)用的研究已成為熱點(diǎn)[7]。

自組裝是天然膠原蛋白的重要分子行為特征，可通過大量非共價(jià)鍵弱相互作用形成具有交錯(cuò)條紋結(jié)構(gòu)的膠原纖維，起到改善膠原蛋白纖維的生物學(xué)性能的作用[8-9]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)賴氨酸和谷氨酸[8]、氨基胍[10]和海藻酸鹽[11]等化合物能夠影響膠原蛋白的自組裝過程，改善其生物特性。

超聲波是一種綠色的物理改性方法，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、可控性好的特點(diǎn)，在食品工業(yè)中已得到廣泛的應(yīng)用[12]。Jiang Ying等[13]發(fā)現(xiàn)超聲波的空化作用能夠提高草魚皮膠原蛋白的自組裝速率，改善其膠原蛋白的黏彈性和結(jié)構(gòu)特性；此外，Akram等[14]也發(fā)現(xiàn)超聲處理改變了雞胸骨軟骨膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，形成了多層和多孔的膠原海綿。盡管魚皮膠原蛋白的自組裝行為已有研究[13]，但關(guān)于鯽魚皮膠原蛋白的自組裝行為還鮮見報(bào)道?，F(xiàn)有研究表明，不同種類魚的外皮膠原蛋白自組裝行為不盡相同，如草魚皮和鱈魚皮的膠原蛋白自組裝行為，兩者表現(xiàn)出完全不同的自組裝歷程[13,15]。因此，本實(shí)驗(yàn)以鯽魚皮膠原蛋白為原材料，通過超聲波預(yù)處理鯽魚皮膠原蛋白，探究超聲波對(duì)鯽魚皮膠原蛋白的自組裝動(dòng)力學(xué)和理化特性的影響，為超聲波在膠原蛋白改性方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鯽魚購(gòu)于鎮(zhèn)江市萬達(dá)廣場(chǎng)蘇果超市；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3由江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院提供。

噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶 美國(guó)Gibco公司；10～170 kDa蛋白Marker北京索萊寶科技公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Lyo Quest真空冷凍干燥機(jī) 西班牙Telstar公司；756CRT紫外-可見分光光度計(jì) 翱藝儀器（上海）有限公司；Mini-Protean垂直電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；F4600熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；Ntegra Prima原子力顯微鏡 俄羅斯NT-MDT公司；XTL-206A顯微鏡上海締倫光學(xué)儀器有限公司；Q700超聲破碎儀 美國(guó)Qsonica公司；HWCL-5集熱式恒溫磁力攪拌浴 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司；J-1500型圓二色光譜儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚皮膠原蛋白的制備

根據(jù)汪海嬰等[16]的方法，將魚皮剔除魚肉后洗滌干凈，切碎，用0.5 mol/L的乙酸溶液于4 ℃下浸提24 h，紗布過濾獲取濾液。重復(fù)提取兩次，收集濾液，5 000 r/min離心30 min，取上清液，添加NaCl固體粉末至終濃度為4 mol/L，攪拌后靜置鹽析24 h，過濾保留沉淀，用0.5 mol/L的乙酸溶液復(fù)溶沉淀，再次添加NaCl至濃度為0.9 mol/L，鹽析保留沉淀，0.5 mol/L乙酸復(fù)溶，先用0.01 mol/L乙酸透析24 h，再用蒸餾水透析12 h，然后冷凍干燥后備用。

1.3.2 超聲處理及樣品制備

將鯽魚皮膠原蛋白以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%溶解于0.5 mol/L的乙酸溶液中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝筮M(jìn)行超聲處理，處理過程中樣品溶液持續(xù)保持在冰浴中；超聲處理的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)為：樣品溶液在不同超聲功率（0、100、200、400、600 W）下處理5 min，用來研究超聲功率對(duì)鯽魚皮膠原蛋白自組裝行為的影響；在此基礎(chǔ)上，選擇適宜的超聲功率，用來研究不同超聲時(shí)間（0、1、5、10、25 min）對(duì)鯽魚皮膠原蛋白自組裝行為的影響。

1.3.3 自組裝行為觀察

根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]的方法，并稍加修改。將超聲波處理的膠原蛋白樣品溶液稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，調(diào)節(jié)pH值至7.2，加入質(zhì)量濃度150 g/L NaCl溶液（pH 7.2）至濃度為0.2 mol/L，立即置于20 ℃水浴中進(jìn)行自組裝，每隔30 s在波長(zhǎng)313 nm處測(cè)定吸光度，繪制自組裝動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

將樣品溶于0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8，甘油質(zhì)量濃度100 g/L、SDS質(zhì)量濃度20 g/L、溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度1 g/L、巰基乙醇質(zhì)量濃度10 g/L），沸水浴處理2 min并離心（5 000 r/min，1 min），取上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，SDS-PAGE凝膠由質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%分離凝膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮凝膠組成，電泳設(shè)定為80 V、20 min，然后120 V、90 min。電泳后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色30 min，并在37 ℃反復(fù)脫色。

1.3.5 熒光光譜分析

利用膠原蛋白內(nèi)源性酪氨酸殘基為熒光標(biāo)記，使用熒光分光光度計(jì)樣品進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為290～500 nm，激發(fā)和發(fā)射光譜狹縫為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min。

1.3.6 圓二色光譜分析

采用J-1500型圓二色光譜儀研究膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，掃描波長(zhǎng)范圍為190～250 nm，比色皿光徑1 mm，帶寬1 nm，分辨率0.5 nm，掃描速率500 nm/min。

1.3.7 微觀結(jié)構(gòu)觀察

原子力顯微鏡觀察：將5 μL自組裝反應(yīng)液（膠原蛋白質(zhì)量濃度1.0 g/L）置于新鮮剝離的云母片表面，20 ℃下自組裝1 h，室溫陰干24 h，置于原子力顯微鏡下觀察。掃描模式為輕敲模式，掃描面積20 μm×20 μm、2 μm×2 μm，所有樣品均在室溫下成像。

顯微鏡觀察：將自組裝產(chǎn)物在-80 ℃快速冷凍，冷凍干燥后，膠原蛋白成海綿狀，剪取厚為1 mm的片狀橫截面，置于黑色載玻片上，在20 倍物鏡下用XTL-206A顯微鏡觀察，并使用連接到顯微鏡的EOS 6D數(shù)碼相機(jī)拍攝照片，每個(gè)樣品連續(xù)拍照100 次，并使用Photoshop CS6軟件對(duì)這些照片進(jìn)行疊加優(yōu)化處理。

1.3.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)[13]。NIH/3T3細(xì)胞（4×103個(gè)/孔）接種在96 孔板中，在37 ℃和體積分?jǐn)?shù)5% CO2下培養(yǎng)12 h后，加入100 μL膠原蛋白溶液（空白對(duì)照組不添加鯽魚皮膠原蛋白），以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）為對(duì)照（未處理組），培養(yǎng)72 h，每孔加入100 μL質(zhì)量濃度1 mg/mL MTT，在37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄掉培養(yǎng)液，再加入100 μL DMSO后振蕩孵育10 min，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲預(yù)處理對(duì)膠原蛋白的組裝動(dòng)力學(xué)影響

圖1 不同超聲條件下鯽魚皮膠原蛋白裝配的濁度-時(shí)間曲線Fig. 1 Turbidity-time curves for self-assembly of collagen from Carassius auratus skin under different ultrasonic treatment conditions

膠原蛋白的自組裝進(jìn)程可分為成核期（吸光度基本不變）、組裝期（吸光度迅速增加）和平衡期（吸光度達(dá)到最大并保持恒定），呈現(xiàn)典型的S型曲線[17]。由圖1可知，鯽魚皮膠原蛋白隨著自組裝時(shí)間的增加，在313 nm波長(zhǎng)處的吸光度先保持不變，然后迅速升高至最高值并保持不變，符合S型曲線特征，這表明本實(shí)驗(yàn)條件下鯽魚皮膠原蛋白能夠正確自組裝。圖1A表明未處理的鯽魚皮膠原蛋白成核期為600 s，組裝期為600～1 400 s；在超聲波100 W和200 W處理后，其成核期為420～480 s，組裝期為480～1 290 s，與超聲處理前相比，成核期明顯縮短，這表明100 W和200 W處理增加了膠原蛋白的纖維形成率；在超聲波400 W和600 W處理后，其成核期為630～690 s，組裝期為1 410～1 440 s，與超聲處理前相比，成核期明顯延長(zhǎng)，這表明400 W和600 W處理降低了膠原蛋白的纖維形成率。研究結(jié)果表明，低功率超聲處理有利于鯽魚皮膠原蛋白的自組裝，其中超聲功率為200 W時(shí)效果最好。

由圖1B可知，超聲時(shí)間對(duì)鯽魚皮膠原蛋白的自組裝進(jìn)程有明顯影響，在200 W處理1～10 min后，鯽魚皮膠原蛋白的成核期從處理前的600 s縮短至390～420 s，超聲處理增加了膠原蛋白的纖維形成率，但隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，膠原纖維形成率的增長(zhǎng)速率卻逐漸越低，其中，200 W處理1 min時(shí)效果最好。此外，超聲處理25 min的鯽魚皮膠原蛋白的自組裝曲線的S型不明顯，這可能是長(zhǎng)時(shí)間的空化作用導(dǎo)致鯽魚皮膠原蛋白部分降解[18]，使其失去自組裝能力。

2.2 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖2 不同超聲條件下鯽魚皮膠原蛋白的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE pattern of collagen from Carassius auratus skin under different ultrasonic treatment conditions

由圖2可知，鯽魚皮膠原蛋白存有兩條120 kDa左右的α亞基和一條200 kDa左右的β亞基，α亞基包含α1亞基和α2亞基，α1亞基的含量約為α2亞基的2 倍，有典型的I型膠原蛋白特征[19-20]。超聲功率對(duì)鯽魚皮膠原蛋白的亞基含量影響不明顯，在超聲功率100～200 W，膠原蛋白的α1亞基的含量繼續(xù)保持在α2亞基的2 倍左右，但當(dāng)超聲功率在400 W和600 W時(shí)，α1亞基的含量略有減少，這種2 倍關(guān)系發(fā)生了改變，說明高功率超聲的空化作用可能引起膠原蛋白局部降解，使膠原蛋白的I型特征逐漸弱化，這與上述超聲功率對(duì)鯽魚皮膠原蛋白自組裝動(dòng)力學(xué)的影響趨勢(shì)基本一致（圖1A）。超聲時(shí)間對(duì)鯽魚皮膠原蛋白的亞基含量略有影響，在1～10 min時(shí)，膠原蛋白的α1亞基的含量基本保持在α2亞基的2 倍左右，但當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)，α1亞基含量與α2亞基含量的2 倍關(guān)系被打破，膠原蛋白的I型特征弱化，這表明長(zhǎng)時(shí)間的超聲空化作用可能會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白發(fā)生部分降解，這一現(xiàn)象與上述超聲時(shí)間對(duì)鯽魚皮膠原蛋白自組裝動(dòng)力學(xué)的影響趨勢(shì)基本一致（圖1B）。

2.3 熒光光譜分析結(jié)果

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是組成蛋白質(zhì)的基本氨基酸，因其含有苯環(huán)或共軛雙鍵結(jié)構(gòu)能夠使蛋白質(zhì)產(chǎn)生內(nèi)源性熒光，常被用來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化[21-22]。在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm處，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基通常在發(fā)射波長(zhǎng)282、305 nm和348 nm處有最高熒光強(qiáng)度，其中，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，而苯丙氨酸殘基的熒光強(qiáng)度最弱，這與其易淬滅有關(guān)[23]。在膠原蛋白中，色氨酸和苯丙氨酸含量通常較低[24]，因此，選擇酪氨酸作為鯽魚皮膠原蛋白的內(nèi)源熒光，如圖3所示。在超聲功率0～400 W，膠原蛋白的最大熒光強(qiáng)度隨著超聲功率的增加而增加；當(dāng)超聲功率增大到600 W時(shí)，膠原蛋白的最大熒光強(qiáng)度下降，但仍然高于未處理組，這表明超聲波的空化作用導(dǎo)致了鯽魚皮膠原蛋白分子伸展，使分子內(nèi)部酪氨酸殘基暴露，熒光強(qiáng)度增加，這與超聲波對(duì)麥胚清蛋白的熒光光譜影響基本一致[25]（圖3A）。超聲時(shí)間對(duì)鯽魚皮膠原蛋白的熒光強(qiáng)度有顯著影響，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)不規(guī)律變化，但都明顯高于未處理組。這表明在超聲波空化作用下，膠原蛋白可能存在分子伸展和自裝配兩個(gè)過程，因?yàn)榉肿由煺钩潭纫h(yuǎn)遠(yuǎn)大于自裝配過程，使分子整體表現(xiàn)為分子伸展[25]（圖3B）。此外，與未處理組相比，超聲處理后鯽魚皮膠原蛋白的發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移了約3 nm，這進(jìn)一步表明超聲處理引起了鯽魚皮膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)變化。

圖3 不同超聲條件下鯽魚皮膠原蛋白的熒光光譜Fig. 3 Fluorescence spectra of collagen from Carassius auratus skin under different ultrasonic treatment conditions

2.4 圓二色光譜分析結(jié)果

圓二色光譜借助于生物大分子的手性結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生左、右旋圓偏振光不同的吸光度，這可以用來分析生物分子結(jié)構(gòu)，在膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)分析中也得到了廣泛應(yīng)用[26]。超聲波處理對(duì)鯽魚皮膠原蛋白圓二色光譜的影響如圖4A、圖5A所示。鯽魚皮膠原蛋白在195～214 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)一個(gè)低谷，在215～235 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)一個(gè)高峰，呈現(xiàn)出典型的Cotton效應(yīng)[27]。膠原蛋白通常在225 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)正吸收峰，在197 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)負(fù)吸收峰[19]，然而鯽魚皮膠原蛋白的負(fù)吸收峰則紅移約9 nm，這主要與膠原蛋白的不同來源、氨基酸序列和分子質(zhì)量大小有關(guān)[26]，如鰱魚鱗膠原蛋白在202 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)負(fù)吸收峰，負(fù)吸收峰同樣紅移了5 nm[28]。正負(fù)Cotton效應(yīng)的比（ratio of positive to negative，RPN）值與膠原蛋白的螺旋程度呈正相關(guān)性，反映了膠原分子中螺旋區(qū)域與非螺旋區(qū)域的相對(duì)含量[29]。與未處理組相比，100 W超聲處理后膠原蛋白的三股螺旋含量基本沒變；但當(dāng)超聲功率在200～600 W時(shí)，鯽魚皮膠原蛋白的三股螺旋含量明顯降低（圖4B）；另外，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，鯽魚皮膠原蛋白的三股螺旋含量也明顯降低（圖5B），這說明高功率和長(zhǎng)時(shí)間的超聲波處理會(huì)引起膠原蛋白解螺旋，出現(xiàn)三股螺旋向單體的轉(zhuǎn)變[30]，最終引起鯽魚皮膠原蛋白的自組裝動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化。

圖4 不同超聲功率下鯽魚皮膠原蛋白的圓二色光譜和RPN值Fig. 4 Circular dichroism spectra and RPN values of collagen from Carassius auratus skin treated with different ultrasonic powers

圖5 不同超聲時(shí)間下鯽魚皮膠原蛋白的圓二色光譜和RPN值Fig. 5 Circular dichroism spectra and RPN values of collagen from Carassius auratus skin with different sonication durations

2.5 鯽魚皮膠原蛋白微觀形態(tài)分析結(jié)果

原子力顯微鏡常被用于觀察膠原蛋白的纖維形態(tài)。將超聲處理前后鯽魚皮膠原蛋白在自組裝環(huán)境下沉積在云母片上，然后采用原子力顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。膠原纖維的分支易發(fā)生交聯(lián)作用，交織后形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[13-16]，未處理的鯽魚皮膠原蛋白纖維之間交聯(lián)性較弱，膠原纖維所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙較大，且分布不均勻；而經(jīng)超聲處理（200 W、1 min）后，膠原纖維交聯(lián)性增強(qiáng)，膠原纖維之間的結(jié)合變得緊密，所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙變小，分布也比較均勻。

圖6 超聲處理前后鯽魚皮膠原蛋白的原子力顯微鏡圖像Fig. 6 Atomic force microscope images for the morphology of collagen from Carassius auratus skin before and after ultrasonic treatment

采用顯微鏡在20 倍物鏡下觀察鯽魚皮膠原蛋白的橫截面（圖7），與未處理的膠原蛋白相比，經(jīng)超聲處理的膠原蛋白形成了更加疏松多孔的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，這一現(xiàn)象與超聲處理對(duì)雞胸骨軟骨膠原蛋白微觀形態(tài)的影響一致[14]。

綜上所述，微觀形態(tài)分析表明了適度超聲波處理不僅能促進(jìn)膠原蛋白的自組裝，而且能夠改善其纖維結(jié)構(gòu)。

圖7 超聲處理前后鯽魚皮膠原蛋白的顯微鏡圖像Fig. 7 Microscopic images for the morphology of collagen from Carassius auratus skin before and after ultrasonic treatment

2.6 NIH/3T3細(xì)胞增殖能力分析結(jié)果

NIH/3T3是小鼠胚胎的成纖維細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)膠原蛋白和細(xì)胞因子的分泌，參與肉芽的生成，修復(fù)損傷與傷口[31]。超聲處理對(duì)鯽魚皮膠原蛋白促進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞增殖能力見圖8。

圖8 超聲處理對(duì)鯽魚皮膠原蛋白的NIH/3T3細(xì)胞增值能力的影響Fig. 8 Effect of ultrasonic treatment on NIH/3T3 cell proliferation capacity of collagen from Carassius auratus skin

由圖8A可知，在相同超聲時(shí)間（5 min）下，超聲功率對(duì)鯽魚皮膠原蛋白促進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞增殖能力有顯著影響（P＜0.05）。與未處理組相比，超聲功率在100 W和200 W下均能顯著提高NIH/3T3細(xì)胞的增殖活性（P＜0.05），其中200 W的效果最好，可使NIH/3T3細(xì)胞的增殖能力提高8.2%；而在400 W和600 W處理下，鯽魚皮膠原蛋白的NIH/3T3細(xì)胞增殖活性略有下降，這可能與高功率超聲處理導(dǎo)致膠原蛋白部分降解有關(guān)。

從圖8B可知，在200 W超聲功率下處理1～10 min，均能顯著提高NIH/3T3細(xì)胞的增殖活性（P＜0.05），其中超聲處理1 min效果最好，比未處理組提高了10.1%；當(dāng)超聲處理25 min后鯽魚皮膠原蛋白的NIH/3T3細(xì)胞增殖活性則顯著下降（P＜0.05），比未處理組降低了7.9%，這可能是長(zhǎng)時(shí)間的超聲空化作用降解了膠原蛋白纖維。上述結(jié)果表明，在超聲功率200 W處理1～10 min均能有效改善鯽魚皮膠原蛋白的NIH/3T3細(xì)胞增殖活性，這可能與超聲處理后膠原蛋白形成多層多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，這些多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)增加了膠原蛋白的比表面積，有利于NIH/3T3細(xì)胞膜吸附作用，促進(jìn)中層黏連蛋白的分泌，從而使細(xì)胞增殖活性增加[32]。

3 結(jié) 論

鯽魚皮膠原蛋白是一種I型膠原蛋白。在超聲200 W處理1 min后，鯽魚皮膠原蛋白的成核期明顯縮短，纖維生成率也得到提高。通過比較超聲波處理前后鯽魚皮膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜、熒光光譜、圓二色光譜和微觀形態(tài)，發(fā)現(xiàn)過度的超聲空化作用會(huì)引起膠原蛋白亞基降解和三股螺旋結(jié)構(gòu)解螺旋，膠原I型特征弱化；與未處理組相比，超聲處理的熒光吸收強(qiáng)度明顯增加，發(fā)射波長(zhǎng)也藍(lán)移約3 nm，自組裝后的膠原蛋白的纖維粗細(xì)均勻、呈現(xiàn)疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明超聲處理改變了鯽魚皮膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)。此外，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，適度超聲波處理能夠顯著改善鯽魚皮膠原蛋白的NIH/3T3細(xì)胞增殖能力（P＜0.05），超聲功率200 W和超聲時(shí)間1 min的條件最佳，與未處理組相比，可使鯽魚皮膠原蛋白的NIH/3T3細(xì)胞增殖活性提高10.1%。