胡曉彤，葉玉潔，石 光，趙南晰，谷明柳，閆宇寧，周嘉寧，安麗萍

（北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

桑黃（Phellinus igniarius）是針層孔菌屬真菌、火木層孔菌，是一種珍貴的多年生大型藥用真菌，寄生于楊、桑、柳、白樺、杜鵑等的樹(shù)干上，在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布[1-3]。現(xiàn)代科學(xué)研究表明[4-5]，桑黃含有多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、多酚類(lèi)、吡喃酮類(lèi)、呋喃類(lèi)等多種成分，桑黃主要活性成分是多糖類(lèi)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[6-13]，是目前公認(rèn)的抗癌效率較高的一種藥用大型真菌[14-16]，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，有“森林黃金”之美稱(chēng)[17]。

目前，有關(guān)桑黃活性成分的報(bào)道大多集中于桑黃中的子實(shí)體，但自然界中桑黃子實(shí)體的生長(zhǎng)速率緩慢，并且對(duì)于有限的桑黃子實(shí)體資源，現(xiàn)有的提取工藝以及活性研究未能使桑黃子實(shí)體得到合理應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)化桑黃子實(shí)體多糖提取工藝，同時(shí)對(duì)桑黃子實(shí)體多糖抗氧化活性進(jìn)行研究，為桑黃子實(shí)體的基礎(chǔ)研究提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑黃 延吉百納和商貿(mào)有限公司；小鼠胚胎成纖維3T3細(xì)胞 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度≥97%） 梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 杭州民康生物技術(shù)有限公司；高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM） 杭州昊天生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國(guó)Sigma公司；小鼠活性氧（reactive oxygen species，ROS）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純；相關(guān)引物由北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Mixer C型恒溫振蕩器、ABI 2720型擴(kuò)增儀 美國(guó)Thermo公司；SPX-100B-Z型恒溫生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；Infinite M200酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 桑黃子實(shí)體多糖的提取

稱(chēng)取凍干的桑黃子實(shí)體，粉碎過(guò)篩，置于熱水中浸提，抽濾后合并濾液濃縮，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇醇沉。通過(guò)木瓜蛋白酶法[18]脫蛋白，取醇沉后多糖5 g置于50 mL水中復(fù)溶，pH 6，加入體積分?jǐn)?shù)2.0%木瓜蛋白酶液，酶解溫度為60 ℃，靜置10 min后沸水浴滅酶5 min，350 r/min離心15 min，透析、冷凍干燥得到桑黃子實(shí)體多糖。

1.3.2 桑黃子實(shí)體多糖提取率測(cè)定

1.3.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

采用苯酚-硫酸法[19]測(cè)定桑黃子實(shí)體多糖提取率，吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL（質(zhì)量濃度0.10 mg/mL）分別加入25 mL比色管中，依次加入5 mL濃硫酸、1 mL體積分?jǐn)?shù)6%苯酚，充分振蕩后，室溫放置15 min，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程y＝12.209x+0.004 5，決定系數(shù)R2＝0.999 6，線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.3.2.2 多糖提取率測(cè)定

將多糖溶液在不同質(zhì)量濃度下測(cè)得的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，計(jì)算得到多糖質(zhì)量濃度。按照公式（1）計(jì)算多糖提取率。

式中：ρ為多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為樣品稀釋倍數(shù)（5、10、15、20、25 倍）；V為樣品體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

影響桑黃子實(shí)體多糖提取率的主要因素有提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)[20-28]，將上述因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3.1 提取溫度對(duì)桑黃子實(shí)體多糖提取率的影響

將凍干桑黃子實(shí)體在提取溫度為60、70、80、90、100 ℃的條件下，按1.3.1節(jié)的方法操作，測(cè)定提取溫度對(duì)桑黃子實(shí)體多糖提取率的影響。

1.3.3.2 提取時(shí)間對(duì)桑黃子實(shí)體多糖提取率的影響

將凍干桑黃子實(shí)體在提取時(shí)間為1、2、3、4、5 h的條件下，按1.3.1節(jié)的方法操作，測(cè)定提取時(shí)間對(duì)桑黃子實(shí)體多糖提取率的影響。

1.3.3.3 料液比對(duì)桑黃子實(shí)體多糖提取率的影響

將凍干桑黃子實(shí)體以料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（m/V）的條件下，按1.3.1節(jié)的方法操作，測(cè)定料液比對(duì)桑黃子實(shí)體多糖提取率的影響。

1.3.3.4 提取次數(shù)對(duì)桑黃子實(shí)體多糖提取率的影響

將凍干桑黃子實(shí)體以提取次數(shù)為1、2、3、4、5 次的條件下，按1.3.1節(jié)的方法操作，測(cè)定提取次數(shù)對(duì)桑黃子實(shí)體多糖提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)4 個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.5 最佳條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)化條件進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，從而驗(yàn)證方法的可行性。

1.3.6 桑黃子實(shí)體多糖的純化

使用瓊脂糖凝膠CL-4B層析柱（10 mm×300 mm，45～165 μm），讓0.1 mol/L NaCl緩沖液按照使用時(shí)流速的1.33 倍流過(guò)，使柱床穩(wěn)定。桑黃子實(shí)體多糖經(jīng)木瓜蛋白酶酶解去蛋白后，1 500 r/min離心10 min，溶于NaCl緩沖液后上樣，樣品體積為總床體積的2%～5%。緩沖液洗脫速率不變，始終避免氣泡進(jìn)入。

1.3.7 桑黃子實(shí)體多糖體外抗氧化活性測(cè)定1.3.7.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

取稀釋到不同質(zhì)量濃度的樣品100 μL加入到96 孔板中，加入DPPH溶液100 μL，充分搖勻后避光處理，置于25 ℃恒溫箱中靜置30 min。陽(yáng)性對(duì)照VC組的處理方法與桑黃子實(shí)體多糖組一致。于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度。按照公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1為不同質(zhì)量濃度樣品（或VC）+DPPH的吸光度；A2為不同質(zhì)量濃度樣品（或VC）+蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水+DPPH的吸光度。

1.3.7.2 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

向96 孔板中加入不同質(zhì)量濃度樣品40 μL和50 mmol/L Tris-HCl溶液120 μL，充分混勻，在37 ℃恒溫箱中放置10 min，再加入2 mmol/L鄰苯三酚溶液40 μL，充分振蕩后，每隔30 s在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度。陽(yáng)性對(duì)照VC組的處理方法與桑黃子實(shí)體多糖組一致。按照公式（3）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

式中：A1為不同質(zhì)量濃度樣品（或VC）+Tris-HCl+鄰苯三酚的吸光度；A2為不同質(zhì)量濃度樣品（或VC）+Tris-HCl+蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水+Tris-HCl+鄰苯三酚的吸光度。

1.3.7.3 羥自由基清除率測(cè)定

向96 孔板中加入不同質(zhì)量濃度樣品50 μL，加入6 mmol/L FeSO4溶液50 μL，加入6 mmol/L H2O2溶液50 μL，振蕩搖勻，在37 ℃恒溫箱中靜置10 min，加入6 mmol/L水楊酸溶液50 μL，振蕩搖勻，在37 ℃恒溫箱中靜置30 min，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。陽(yáng)性對(duì)照VC組的處理方法與桑黃子實(shí)體多糖組一致。按照公式（4）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A1為不同質(zhì)量濃度樣品（或VC）+硫酸亞鐵+H2O2+水楊酸；A2為不同質(zhì)量濃度樣品（或VC）+硫酸亞鐵+蒸餾水+水楊酸；A0為蒸餾水+硫酸亞鐵+H2O2+水楊酸。

1.3.8 3T3細(xì)胞培養(yǎng)

3T3細(xì)胞接種于含完全培養(yǎng)液（體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS+體積分?jǐn)?shù)為90%的DMEM）的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后用新鮮完全培養(yǎng)液替換培養(yǎng)液。細(xì)胞接種于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 3T3細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.9.1 3T3細(xì)胞存活率的測(cè)定

將桑黃子實(shí)體多糖用DMEM培養(yǎng)基分別稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1、10、100 μg/mL，備用。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整3T3細(xì)胞懸液濃度為2.5×104個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于96 孔板，每孔中加入細(xì)胞懸液100 μL，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)分為空白組（細(xì)胞懸液100 μL）、空白+1 μg/mL多糖組、空白+10 μg/mL多糖組、空白+100 μg/mL多糖組、模型組（細(xì)胞懸液100 μL+D-gal）、模型+1 μg/mL多糖組、模型+10 μg/mL多糖組、模型+100 μg/mL多糖組?？瞻捉M和模型組每孔分別加入100 μL完全培養(yǎng)液，空白+多糖組與模型+多糖組每孔分別加入100 μL不同質(zhì)量濃度的多糖，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，模型組和模型+多糖組每孔吸出100 μL上清液，再加入100 μL 800 mmol/LD-gal溶液，損傷48 h。損傷結(jié)束后，每孔各加20 μL MTT（質(zhì)量濃度5 mg/mL），4 h后將上清液吸出，加入150 μL二甲基亞砜，搖勻，37 ℃放置10 min，通過(guò)酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[28]。細(xì)胞存活率按照公式（5）計(jì)算。

式中：As為給藥組吸光度；Ab為空白組吸光度。

1.3.9.2 3T3細(xì)胞的β-半乳糖苷酶染色及觀(guān)察

將3T3細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)/mL接種于6 孔板中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。模型組+多糖組給予桑黃子實(shí)體多糖（200 μg/mL）預(yù)處理24 h后，分別給予800 mmol/LD-gal處理48 h。模型組細(xì)胞則單獨(dú)給予800 mmol/LD-gal處理48 h。損傷結(jié)束后，緩慢吸去孔板內(nèi)各孔的溶液，每孔細(xì)胞用1 mL磷酸鹽緩沖液漂洗2 次。每孔加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液，室溫孵育6～7 min。1 mL磷酸鹽緩沖液漂洗各孔3 次后，每孔加入1 mL染色工作液。密封孔板，避光，置于37 ℃無(wú)CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。次日于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察變?yōu)樯钏{(lán)色的陽(yáng)性表達(dá)β-半乳糖苷酶（senescence-associated-βgalactose，SA-β-gal）的細(xì)胞[29]。

1.3.9.3 3T3細(xì)胞上清液ROS水平、MDA濃度、CAT活力測(cè)定

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞上清液中ROS水平、MDA濃度、CAT活力。

1.3.9.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)Nrf2-ARE信號(hào)通路中相關(guān)基因mRNA表達(dá)量

RNA提?。赫{(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，加入到6 孔板并放入CO2培養(yǎng)箱中保持37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；D-gal+多糖組細(xì)胞給予桑黃多糖（100 μg/mL）預(yù)處理24 h后，分別給予800 mmol/L的D-gal處理48 h，D-gal組細(xì)胞則單獨(dú)給予800 mmol/L的D-gal處理48 h，陽(yáng)性對(duì)照組為比拉西坦，與多糖組劑量一致；損傷結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液將細(xì)胞潤(rùn)洗3 次，嚴(yán)格依據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

RNA質(zhì)量鑒定：將2.8.1節(jié)中的RNA進(jìn)行濃度及純度的測(cè)定，用焦碳酸二乙酯水調(diào)空白。在核酸檢測(cè)儀中測(cè)定在260、280 nm波長(zhǎng)處的OD值。樣本純度合格標(biāo)準(zhǔn)：OD260nm/OD280nm＝2.1～2.2，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）：嚴(yán)格依據(jù)HiScript?II One Step RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)中詳盡的操作步驟進(jìn)行前期處理，檢測(cè)桑黃多糖對(duì)NIH/3T3細(xì)胞中Nrf2、GCLM、NQO1、GCLC的mRNA表達(dá)量。

PCR引物設(shè)計(jì)：從基因庫(kù)中找到目標(biāo)基因序列號(hào)，對(duì)其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以β-actin作為對(duì)照參考基因，引物序列見(jiàn)表2。

表2 Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)基因檢測(cè)的引物序列Table 2 Primer sequences used to detect genes related to Nrf2-ARE signaling pathway

應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括2×一步法混合25 μL、一步法酶混合2.5 μL、上下游基因特異性引物（10 μmol/L）各2 μL、模板RNA 1 μL，無(wú)核糖核酸酶雙蒸水補(bǔ)至50 μL。 擴(kuò)增條件：將總體積50 μL的反應(yīng)體系在94 ℃條件下變性2 min，退火（30 個(gè)循環(huán)：94 ℃、30 s；55～72 ℃、30 s；72 ℃、30 s），延伸：72 ℃、5 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

單因素試驗(yàn)及體外活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖表均采用GraphPad Prism 5.0軟件處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件完成，方差分析比較差異顯著性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）及提取次數(shù)（D）對(duì)桑黃子實(shí)體多糖提取率的影響Fig. 1 Effects of extraction temperature (A), extraction time (B),solid-to-solvent ratio (C) and extraction cycles (D) on the extraction efficiency of polysaccharide from Phellinus igniarius fruiting bodies

提取溫度、提取時(shí)間、料液比及提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖1，當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，提取液中多糖提取率最大，因此選擇70、80、90 ℃作為正交試驗(yàn)的因素水平；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率逐漸增加，當(dāng)時(shí)間為3 h時(shí)，多糖提取率最大，當(dāng)時(shí)間大于3 h時(shí)，多糖提取率呈下降趨勢(shì)，因此選擇2、3、4 h作為正交試驗(yàn)的因素水平；隨著料液比的增加，多糖浸提充分，當(dāng)料液比為1∶30（m/V）時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加料液比，多糖提取率略有降低，因此選擇料液比為1∶20、1∶30、1∶40（m/V）作為正交試驗(yàn)的因素水平；當(dāng)提取次數(shù)為2 次時(shí)，多糖提取率最高，因此選擇提取1、2、3 次作為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 桑黃子實(shí)體多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 3 Orthogonal array design with range analysis of experimental results from Phellinus igniarius fruiting bodies

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Results of variance analysis

正交試驗(yàn)與方差分析結(jié)果分別如表3、4所示，因素A中IIj/3＞IIIj/3＞Ij/3，因素B中IIIj/3＞Ij/3＞IIj/3，因素C中IIIj/3＞Ij/3＞IIj/3，因素D中IIIj/3＞IIj/3＞Ij/3，但R值A(chǔ)＞D＞B＞C，可知各因素對(duì)桑黃粗多糖提取率影響由大到小依次為提取溫度＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞料液比。最佳因素的水平組合為A2B3C3D3，故最后選用A2B3C3D3為最佳提取條件，即提取溫度80 ℃、提取時(shí)間3 h、料液比1∶40（m/V）、提取次數(shù)4 次。

2.3 最佳提取條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及多糖純化結(jié)果

由表5可見(jiàn)，確定的最佳提取工藝與正交試驗(yàn)中的多糖提取率最高值（6.75%）接近，且重復(fù)性較好，進(jìn)一步確定了提取桑黃多糖的提取工藝為A2B3C3D3，此條件下的桑黃子實(shí)體多糖提取率為6.64%。多糖經(jīng)純化后，透析48 h除鹽，測(cè)得多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為76.28%。

2.4 桑黃子實(shí)體多糖體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果

圖2 桑黃子實(shí)體多糖DPPH自由基清除率Fig. 2 DPPH radical scavenging rates of the polysaccharide from Phellinus igniarius fruiting bodies

如圖2所示，桑黃子實(shí)體多糖對(duì)DPPH自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增加，質(zhì)量濃度在0～1.25 mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率上升迅速，此后呈降低趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度1.25 mg/mL時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)子實(shí)體多糖的DPPH自由基清除率為77.14%；陽(yáng)性對(duì)照VC組的DPPH自由基清除率在質(zhì)量濃度2.50 mg/mL時(shí)達(dá)到最高，為85.50%。

2.4.2 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定結(jié)果

圖3 桑黃子實(shí)體多糖超氧陰離子自由基清除率Fig. 3 Superoxide anion radical scavenging rates of the polysaccharide from Phellinus igniarius fruiting bodies

如圖3所示，質(zhì)量濃度在0～0.5 mg/mL時(shí)桑黃子實(shí)體多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增加，此后呈降低趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最高，超氧陰離子自由基清除率為31.22%；陽(yáng)性對(duì)照VC組在質(zhì)量濃度2.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最高，超氧陰離子自由基清除率為85.40%。

2.4.3 羥自由基清除率測(cè)定結(jié)果

圖4 桑黃子實(shí)體多糖羥自由基清除率Fig. 4 Hydroxyl radical scavenging rates of the polysaccharide fromPhellinus igniarius fruiting bodies

如圖4所示，質(zhì)量濃度在0～1.25 mg/mL時(shí)桑黃子實(shí)體多糖對(duì)羥自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增加，此后呈降低趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度1.25 mg/mL時(shí)達(dá)到最高，羥自由基清除率為56.86%；陽(yáng)性對(duì)照VC組在質(zhì)量濃度2.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最高，羥自由基清除率為80.66%。

2.5 桑黃子實(shí)體多糖對(duì)D-gal誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

2.5.1 桑黃子實(shí)體多糖對(duì)3T3細(xì)胞存活率的影響

圖5 桑黃子實(shí)體多糖對(duì)3T3細(xì)胞存活率的影響Fig. 5 Effect of the polysaccharide from Phellinus igniarius fruiting bodies on the survival rate of 3T3 cells

如圖5所示，桑黃子實(shí)體多糖對(duì)3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)毒性，質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率極顯著增加（P＜0.01）。

2.5.2 桑黃子實(shí)體多糖對(duì)D-gal損傷3T3細(xì)胞存活率的影響

圖6 桑黃子實(shí)體多糖對(duì)D-gal損傷3T3細(xì)胞存活率的影響Fig. 6 Effect of the polysaccharide from Phellinus igniarius fruiting bodies on the survival rate of D-gal-injured 3T3 cells

如圖6所示，經(jīng)D-gal誘導(dǎo)損傷后，模型組3T3細(xì)胞的存活率受到極顯著抑制（P＜0.01），與正常組相比，其存活率下降為67.1%。經(jīng)桑黃子實(shí)體多糖處理后，細(xì)胞的增殖活性呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率極顯著增加（P＜0.01）。

2.5.3 3T3細(xì)胞SA-β-gal染色結(jié)果

圖7 3T3細(xì)胞SA-β-gal染色結(jié)果Fig. 7 SA-β-gal staining of 3T3 cells

SA-β-gal活性檢測(cè)結(jié)果顯示（圖7），染為深藍(lán)色的細(xì)胞為SA-β-gal陽(yáng)性表達(dá)的衰老細(xì)胞。與空白組相比，模型組的衰老細(xì)胞明顯增多，衰老細(xì)胞體積較大且形態(tài)不規(guī)則；而桑黃子實(shí)體多糖處理組與模型組相比，SA-β-gal染色陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量則明顯減少。

2.5.4 3T3細(xì)胞外液中ROS水平、MDA濃度、CAT活力測(cè)定結(jié)果

圖8 細(xì)胞外液中ROS水平（A）、MDA濃度（B）、CAT活力（C）測(cè)定結(jié)果Fig. 8 ROS levels (A), MDA concentration (B) and CAT activity (C)in extracellular fluid

如圖8所示，與模型組相比，桑黃子實(shí)體多糖組可以顯著降低3T3細(xì)胞外液中ROS水平（P＜0.05）；極顯著降低MDA濃度（P＜0.01）；顯著提高CAT活性（P＜0.05）。

2.5.5 桑黃子實(shí)體多糖對(duì)衰老細(xì)胞中Nrf2-ARE信號(hào)通路中相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

桑黃子實(shí)體多糖對(duì)衰老細(xì)胞中Nrf2-ARE信號(hào)通路中相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響如表6所示。

表6 3T3細(xì)胞中相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（n＝6）Table 6 Relative expression of related genes in 3T3 cells (n= 6)

圖9 部分小鼠腦組織中基因表達(dá)情況Fig. 9 Gene expression in brain tissues of mice

如表6和圖9所示，對(duì)Nrf2通路以及下游的3 個(gè)基因的表達(dá)情況分別進(jìn)行了測(cè)定。與模型組相比，桑黃多糖組中Nrf2通路及其3 個(gè)下游基因（GCLC、NQO1和GCLM）的mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了桑黃子實(shí)體多糖的提取工藝，獲得的桑黃子實(shí)體多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為從桑黃子實(shí)體中提取更高活性多糖及其規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

氧化應(yīng)激是機(jī)體過(guò)量的自由基產(chǎn)生和抗氧化防御之間不平衡的結(jié)果，可導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷。食藥用真菌內(nèi)有大量生物學(xué)活性成分，抗氧化活性是諸多生物學(xué)活性中最重要的活性之一。DPPH自由基清除率是評(píng)價(jià)各種抗氧化劑清除自由基能力的常用指標(biāo)。超氧陰離子自由基是相對(duì)較弱的氧化劑，在超氧化物歧化酶中可以被不斷降解，形成H2O2、羥自由基等ROS。羥自由基易穿透細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和機(jī)體病理改變。結(jié)果顯示，桑黃子實(shí)體多糖具有清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的能力，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，具有成為天然抗氧化劑的藥物潛力。

體內(nèi)積累的D-gal可引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。由于體內(nèi)存在的半乳糖氧化酶可將其氧化為-CHO、H2O2、超氧陰離子自由基，導(dǎo)致體內(nèi)ROS的過(guò)量產(chǎn)生而引起氧化應(yīng)激損傷[30]。ROS水平、CAT活力、MDA含量等標(biāo)記物的測(cè)定能反映氧化損傷的程度，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示桑黃子實(shí)體多糖可促進(jìn)3T3細(xì)胞增殖，顯著降低細(xì)胞外液中ROS水平及MDA含量，提高CAT活力。表明桑黃子實(shí)體多糖對(duì)D-gal誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

通過(guò)RT-PCR技術(shù)初步探索桑黃子實(shí)體多糖的抗氧化作用在基因水平上的表現(xiàn)，可推斷桑黃子實(shí)體多糖通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2通路，提高GCLC、NQO1、GCLM的表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用。初步證明桑黃子實(shí)體多糖的抗氧化的基因表型。明確了桑黃子實(shí)體多糖的抗氧化活性，及其對(duì)D-gal誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并且可初步推斷其抗氧化的作用是由Nrf2通路介導(dǎo)的。這將為發(fā)現(xiàn)天然抗氧化劑奠定基礎(chǔ)，為更好地開(kāi)發(fā)和利用桑黃這一藥用菌物資源提供科學(xué)依據(jù)。