李德新　李華　李飛　趙曉晨　李茂德　安祥　蘭戴天

摘要：目的 ?探討不同程度CDCA5表達(dá)在裸鼠肝細(xì)胞癌中的作用及臨床價(jià)值。方法 ?取HepG2正常細(xì)胞組、CDCA5低表達(dá)組、CDCA5高表達(dá)組、HepG2肝癌細(xì)胞株，將高表達(dá)組、低表達(dá)組CDCA5高效轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，并設(shè)陰性對(duì)照組（NC組）。免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h后各組CDCA5蛋白的表達(dá)水平，CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24、48、72、96、120 h 各組細(xì)胞的增殖能力，Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)低表達(dá)組轉(zhuǎn)染48 h的凋亡情況;將HepG2正常細(xì)胞組，CDCA5低表達(dá)組的細(xì)胞分別注射于裸鼠成瘤，觀察成瘤時(shí)間，第30天處死小鼠，觀察瘤體狀態(tài)。免疫組化檢測(cè)CDCA5在裸鼠腫瘤中的表達(dá)。結(jié)果 ?高表達(dá)和低表達(dá)組的CDCA5蛋白水平均高于NC組（P<0.05）;自轉(zhuǎn)染48 h起，高表達(dá)組和低表達(dá)組的相對(duì)增殖率均高于NC組（P<0.05）;高表達(dá)組和低表達(dá)組轉(zhuǎn)染72 h后的相對(duì)增殖率分別為（130.03±0.35）%和（70.10±1.04）%，均高于其他觀察時(shí)間點(diǎn)（P<0.05）;低表達(dá)組轉(zhuǎn)染48 h的早期和晚期凋亡率均高于NC組（P<0.05）;裸鼠皮下注射普通HepG2細(xì)胞組及CDCA5低表達(dá)HepG2細(xì)胞，瘤體重量分別為（0.93±0.06）g、（0.69±0.10）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CDCA5在低表達(dá)組裸鼠腫瘤組織中表達(dá)降低。結(jié)論 ?CDCA5能促進(jìn)HepG2癌細(xì)胞的增殖，可通過調(diào)控CDCA5表達(dá)水平，有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

關(guān)鍵詞：CDCA5;肝癌;裸鼠;預(yù)后

中圖分類號(hào)：R735.7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.18.015

文章編號(hào)：1006-1959（2020）18-0048-03

The Role and Clinical Value of CDCA5 in Nude Mice Hepatocellular Carcinoma

LI De-xin，LI Hua，LI Fei，ZHAO Xiao-chen，LI Mao-de，AN Xiang，LAN Dai-tian

（Sichuan Academy of Medical Sciences/Hepatobiliary Surgery，Sichuan Provincial People's Hospital，

Chengdu 610010，Sichuan，China）

Abstract：Objective ?To explore the role and clinical value of different levels of CDCA5 expression in nude mice hepatocellular carcinoma.Methods ?HepG2 normal cell group， CDCA5 low expression group， CDCA5 high expression group and HepG2 hepatocarcinoma cell lines were selected. The high expression group and low expression group CDCA5 were efficiently transfected into human liver cancer HepG2 cells， and a negative control group （NC group） was established. Western blotting was used to detect the expression level of CDCA5 protein in each group after 24 h of transfection. CCK-8 method was used to detect the proliferation ability of cells in each group after transfection 24， 48， 72， 96， 120 h. Annexin V-FITC/PI double label flow Cytometry was used to detect the apoptosis of the low expression group for 48 h after transfection; the HepG2 normal cell group and the CDCA5 low expression group were injected into nude mice to form tumors， and the tumor formation time was observed. The mice were killed on the 30th day and the tumors were observed body state. Immunohistochemistry was used to detect the expression of CDCA5 in tumors of nude mice.Results ?The CDCA5 protein levels of the high and low expression groups were higher than those of the NC group （P<0.05）; since 48 h after transfection， the relative proliferation rates of the high and low expression groups were higher than those of the NC group （P<0.05）; The relative proliferation rates of high expression group and low expression group 72 h after transfection were （130.03±0.35）% and （70.10±1.04）%， respectively， which were higher than other observation time points （P<0.05）; low expression group was transfected the early and late apoptosis rates at 48 h were higher than those in the NC group （P<0.05）; the nude mice were subcutaneously injected with ordinary HepG2 cells and CDCA5 low-expressing HepG2 cells， and the tumor weights were （0.93±0.06） g and （0.69±0.10）g， the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression of CDCA5 in the tumor tissues of nude mice in the low expression group decreased.Conclusion ?CDCA5 can promote the proliferation of HepG2 cancer cells， and could effectively inhibit the proliferation of liver cancer cells and promote their apoptosis by regulating the expression level of CDCA5.

Key words：CDCA5;Liver cancer;Nude mice;Prognosis

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤，患者就診時(shí)往往病情嚴(yán)重、預(yù)后較差，病死率高，目前主要以手術(shù)治療、放療、化療、生物治療等綜合治療為主[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期具有重要的相關(guān)性，對(duì)腫瘤細(xì)胞周期異常蛋白的調(diào)控成為治療靶點(diǎn)。CDCA5在多種腫瘤組織中表達(dá)均增加[2-4]，這提示CDCA5在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中可能起到重要的作用。本研究通過CDCA5細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，探討低表達(dá)CDCA5在肝癌細(xì)胞中的功能，試圖尋找生物治療新的方向提供參考。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器 ?收集HepG2正常細(xì)胞組，CDCA5低表達(dá)組，CDCA5高表達(dá)組，HepG2肝癌細(xì)胞株，DMEM 高糖培養(yǎng)基，10%胎牛血清和25%胰蛋白酶，小鼠抗CD-CA5抗體，小鼠抗GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體，電泳、電轉(zhuǎn)裝置，BCA蛋白定量試劑盒購，免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑，ECL流式細(xì)胞儀，慢病毒pSICOR、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，DNA凝膠回收試劑盒，青鏈霉，PBS，碘化丙啶，菌種DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) ?SMMC-7721、HepG2細(xì)胞 用含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ?SPF級(jí)BAlB/C-nu/nu裸小鼠，4～6周齡，體重18～20 g，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，在SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)。

1.4 Western blotting檢測(cè)各組CDCA5蛋白表達(dá)水平 ?細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后提取高表達(dá)組、低表達(dá)組、NC組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整為2 μg/μl，取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳（5%濃縮膠60 V×40 min，10%分離膠100 V×60 min），4 ℃200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，室溫封閉1 h，分別加CDCA5一抗（1∶1000）、GAPDH一抗（1∶2000），4 ℃過夜，二抗（1∶5000）室溫孵育1 h。將PVDF膜置于 ECL中反應(yīng)，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，采集圖像，應(yīng)用Quantity one進(jìn)行灰度分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量用CDCA5灰度值與內(nèi)參 GAPDH 的比值計(jì)算。

1.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 ?細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h制作單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24、48、72、96 h，加入 CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，取450 nm波長處檢測(cè)每孔的吸光值（A），相對(duì)增殖率（%）=各組A/NC組A×100%計(jì)算。

1.6檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 ?各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h制作單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞移入離心管，離心5 min，棄上清，PBS溶液洗滌，收集提取重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC 4 ℃孵育15 min，加入5 μl PI混勻孵育15 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡率。

1.7檢測(cè)CDCA5在裸鼠腫瘤中的表達(dá) ?將HepG2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，用慢病毒pSICOR、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro感染，收集HepG2正常細(xì)胞組，CDCA5低表達(dá)組，CDCA5高表達(dá)組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，用0.25%的胰酶消化轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管并計(jì)數(shù)，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度1×107個(gè)/ml。每只小鼠皮下注射0.2 ml，自接種之日起每天觀察裸鼠狀態(tài)，成瘤時(shí)間及瘤體生長情況。第30天處死裸鼠，取出腫瘤，稱重并計(jì)算每組腫瘤的平均瘤重。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?采用SPSS軟件IBM version 22.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料的表示采用（x±s）表示，多組計(jì)量數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法計(jì)算患者的累積無瘤生存率（RFS）及總生存率（OS）。采用Log-rank法進(jìn)行單因素分析，比較生存時(shí)間的差異。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CDCA5在肝癌細(xì)胞株的表達(dá) ?HepG2肝癌細(xì)胞株CDCA5蛋白表達(dá)量最高，SMMC-7721細(xì)胞株CDCA5蛋白表達(dá)量最低，構(gòu)建敲低及高表達(dá)CDCA5的質(zhì)粒，Western blot檢測(cè)敲低及過表達(dá)CDCA5后的變化。對(duì)照組、陰性對(duì)照組、CDCA5低表達(dá)組、CDCA5高表達(dá)組蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.59±0.14）、（0.56±0.16）、（0.06±0.02）、（0.77±0.11），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;另外，低表達(dá)組的表達(dá)量最低，抑制效率最高，與各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2肝癌細(xì)胞增殖 ?檢測(cè)低表達(dá)和高表達(dá)細(xì)胞生長增殖情況，生長情況以NC組作對(duì)照，轉(zhuǎn)染 24 h后與空白組相對(duì)增殖率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），轉(zhuǎn)染48、72 h后，低表達(dá)組HepG2細(xì)胞抑制率分別為（65.97±0.58）%、（70.10±1.04）%。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長肝癌細(xì)胞增殖率受抑制;高表達(dá)組HepG2細(xì)胞存活率分別為（128.93±0.95）%、（130.03±0.35）%。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長，肝癌細(xì)胞存活率逐漸增強(qiáng)，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3細(xì)胞凋亡情況 ?低表達(dá)組轉(zhuǎn)染48 h的早期和晚期凋亡率分別為（19.43±2.31）%、（24.37±2.21）%均高于對(duì)照組的（4.30±0.73）%、（6.13±1.58）%及陰性對(duì)照組的（4.43±0.36）%、（6.67±2.91）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。陰性對(duì)照組與對(duì)照組早期和晚期凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4成瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè) ?裸鼠皮下分別注射普通HepG2細(xì)胞及CDCA5低表達(dá)HepG2細(xì)胞，對(duì)照組第6天出現(xiàn)腫瘤，CDCA5低表達(dá)組第7天出現(xiàn)腫瘤。瘤體逐漸增大，直至第30天對(duì)照組瘤體重量分別為（0.93±0.06）g，CDCA5低表達(dá)組（0.69±0.10）g，隨著時(shí)間推移對(duì)癥組瘤體重量高于CDCA5低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5免疫組化檢測(cè)CDCA5 ?對(duì)照組、低表達(dá)組織中CDCA5蛋白的陽性表達(dá)率分別為 86.5%、31.8%，在低表達(dá)組裸鼠腫瘤組織中CDCA5陽性率限制降低，見圖2。

3討論

原癌基因激活、抑癌基因失活、相關(guān)基因表達(dá)異常、細(xì)胞增殖和凋亡能力失常、生長因子和受體異常表達(dá)等導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[5，6]。臨床研究顯示細(xì)胞增殖及凋亡失控是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制[7]。細(xì)胞周期蛋白表達(dá)異常尤為突出，因此調(diào)節(jié)和抑制細(xì)胞周期蛋白酶，可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展，延緩或終止腫瘤組織形成。本研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5在HCC癌及裸鼠成瘤組織中表達(dá)量升高，提示可以通過調(diào)控CDCA5干預(yù)肝癌的形成。相關(guān)研究提示CDCA5可能在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。對(duì)于CDCA5功能的研究比較缺乏。本研究結(jié)果顯示隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長，肝癌細(xì)胞存活率增強(qiáng)，通過CDCA5低表達(dá)觀察在肝癌HepG2細(xì)胞和裸鼠成瘤中發(fā)生發(fā)展的功能進(jìn)一步探討。

既往部分研究提示CDCA5可預(yù)測(cè)癌癥患者的預(yù)后。在尿路上皮細(xì)胞癌、口腔鱗癌、非小細(xì)胞肺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5高表達(dá)與總生存率、局部或是全身復(fù)發(fā)、預(yù)后具有密切聯(lián)系，可認(rèn)為是其危險(xiǎn)因素[8，9]。本研究中低表達(dá)組轉(zhuǎn)染48h的早期和晚期凋亡率分別為（19.43±2.31）%、（24.37±2.21）%，均高于對(duì)照組。此外我們，發(fā)現(xiàn)CDCA5 陽性表達(dá)率越高，腫瘤分化程度越差，這表示CDCA5具有加速肝癌細(xì)胞分裂，參與肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制 ，從而導(dǎo)致腫瘤惡性程度增高，在裸鼠成瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步證實(shí)。

肝癌分期把腫瘤直徑作為一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，評(píng)估患者預(yù)后。本研究通過裸鼠皮下注射普通HepG2細(xì)胞及CDCA5低表達(dá)HepG2細(xì)胞，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。敲低CDCA5裸鼠腫瘤組織直徑較小，生長周期延長，說明調(diào)控CDCA5的表達(dá)對(duì)腫瘤的預(yù)后具有一定的作用。但只以腫瘤直徑判斷預(yù)后具有局限性，需結(jié)合腫瘤生物學(xué)特性，從而讓腫瘤直徑指標(biāo)對(duì)患者預(yù)后更有價(jià)值。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)控CDCA5 表達(dá)水平，有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。從而對(duì)肝癌基因靶向治療初步提供了一個(gè)新的方向，CDCA5的異常增高有望成為肝細(xì)胞癌早期診斷和病情判斷的一項(xiàng)參考指標(biāo)，就CDCA5在肝癌中的特異性及信號(hào)通路可作為突破口。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱繼業(yè)，李照.中晚期肝癌的轉(zhuǎn)化手術(shù)切除[J].腹部外科，2020，2（4）：105-108.

[2]Tokuzen N，Nakashiro KI，Tanaka H，et al.Therapeutic potential of targeting cell division cycle associated 5 for oral squamous cell carcinoma[J].Oncotarget，2016，7（3）：2343-2353.

[3]Lampropoulou E，Logoviti I，Koutsioumpa M，et al.Cyclin-dependent kinase 5 mediates pleiotrophin-induced endothelial cell migration[J].Entific Reports，2018，8（1）：5893.

[4]Zhang X，Yan Z，Wang L，et al.STAT1‐induced upregulation of lncRNA RHPN1‐AS1 predicts a poor prognosis of hepatocellular carcinoma and contributes to tumor progression via the miR‐485/CDCA5 axis[J].Journal of Cellular Biochemistry，2020.

[5]Erlinda G，Joshua R，Seiya L，et al.Cell cycle checkpoint control：The cyclin G1/Mdm2/p53 axis emerges as a strategic target for broadspectrum cancer gene therapy-A review of molecular mechanisms for oncologists[J].Molecular and Clinical Oncology，2018，9（2）：115-134.

[6]聶佳歡，侯世科，程明.分子靶向藥物在肝細(xì)胞癌臨床治療中的研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)藥，2020，8（4）：1234-1239.

[7]Otto T，Sicinski P.Cell cycle proteins as promising targets in cancer therapy[J].Nature Reviews Cancer，2017，17（2）：93-115.

[8]Chang IW，Lin CH，He HL，et al.CDCA5 overexpression is an indicator of poor prognosis in patients with urothelial carcinomas of the upper urinary tract and urinary bladder[J].American Journal of Translational Research，2015，7（4）：710-722.

[9]Jing X，Chengxiang Z，Yue Y，et al.Systematic cancer-testis gene expression analysis identified CDCA5 as a potential therapeutic target in esophageal squamous cell carcinoma[J]. EBio Medicine，2019，10（7）：54-65.

收稿日期：2020-05-25;修回日期：2020-06-16

編輯/錢洪飛

基金項(xiàng)目：四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院2017年院科研基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：2017LY19）

作者簡介：李德新（1983.11-），男，四川成都人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肝膽胰腺疾病的基礎(chǔ)與臨床研究

通訊作者：李華（1985.7-），女，四川廣安人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腹部及心臟超聲診斷工作