張棋麟 ，江宇航，董志祥，羅智文，林連兵 ?

1.昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南 昆明 650500； 2.云南省高校飼用抗生素替代技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650500

汞被聯(lián)合國列為威脅人類健康和環(huán)境的十大污染物之一，并受到了廣泛的關(guān)注（Morelet al.，1998；Liet al.，2009a）。汞對水體污染十分嚴重，水環(huán)境中汞主要以3種形態(tài)存在：單質(zhì)態(tài)、無機態(tài)（如氯化汞 (HgCl2，HGC) 等）和有機態(tài)（如甲基汞等）（Monteiro et al.，2010；Marceloet al.，2013）。汞是一種難降解、易遷移、高濃度、劇毒的全球重金屬污染物。因此，世界上許多水體都存在因汞含量過高而造成的潛在環(huán)境風險。例如，在美國卡森河流域，廢棄金礦附近的水體中總汞濃度已經(jīng)達到了2 474 ng·L-1（Morway et al.，2017）；印度西亞印第安納州，某些黃金礦區(qū)附近的河流水體中總汞含量最高可達37 300 ng·L-1（Inoue et al.，2016）；此外，中國貴州省銅仁汞礦區(qū)的地表水總汞含量也高達到81.6—4 250 ng·L-1（夏吉成等，2016）。水體汞污染作為一種典型的有害物質(zhì)，在環(huán)境科學領(lǐng)域得到了廣泛的研究和調(diào)查。然而，目前較少有研究探討水體中汞對魚類的影響。

腸道菌群在宿主的健康與疾病中扮演了重要的角色，被稱為宿主的第二基因組（Backhedet al.，2007）。腸道菌群功能的發(fā)揮依賴于腸道菌群的組成與結(jié)構(gòu)，當受到外源物刺激時，可能會導致腸道菌群紊亂，使宿主發(fā)生炎癥甚至死亡。例如，當成年鯉（Cyprinus carpio）暴露于含有重金屬鎘的水溶液后，會導致鯉腸道菌群的多樣性降低，且腸道內(nèi)益生菌Akkermansia muciniphila的相對豐度顯著下降（Changet al.，2019）；通過對暴露于重金屬鉛的成年斑馬魚進行研究，研究者發(fā)現(xiàn)其腸道菌群的多樣性與對照組相比發(fā)生了顯著改變，并導致其腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)生功能紊亂（Xiaet al.，2018）；鯽（Carassius auratus）腸道菌群也會隨著氨溶液暴露濃度的變化而改變（Qiet al.，2017）。此外，魚體內(nèi)的抗氧化酶防御體系對環(huán)境污染物敏感，因此魚類組織中的抗氧化酶能作為環(huán)境污染物的生物標記物（Ahmad et al.，2006；Oliveira et al.，2008）。有研究報道了重金屬類污染物能在魚類的不同組織中積累，影響體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量的變化，尤其是肝組織對水體污染物的毒害反應(yīng)最為敏感，可直接影響組織中的抗氧化酶系統(tǒng)，誘導細胞凋亡和造成機體損傷等（劉林等，2015a）。以上研究表明，水體污染物對魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝組織影響巨大，對魚類的健康造成了威脅。然而，迄今為止，人們對汞如何影響魚類腸道菌群及肝組織抗氧化性能的認識仍較為有限。

斑馬魚（Danio rerio）是國際標準化組織（ISO）推薦使用的魚類毒性試驗動物，因此被廣泛應(yīng)用于毒理學、環(huán)境保護、發(fā)育生物學等研究，已成為一種重要的生物模型（宋志慧等，2012；Maet al.，2013）。當斑馬魚暴露于水體污染物時，其能在不同層面上（如行為、生理、表型、基因表達等）對環(huán)境非生物壓力做出不同程度的響應(yīng)，因此被稱為水環(huán)境污染風險評估的“活監(jiān)測儀”（Huet al.，2016）。然而，斑馬魚腸道菌群和肝臟抗氧化酶活性對重金屬污染物的響應(yīng)研究并不多見，尤其針對汞的相關(guān)報道還未發(fā)現(xiàn)。本研究以模式生物斑馬魚為對象，通過汞暴露誘發(fā)斑馬魚成魚腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝臟中抗氧化酶活性的變化，旨在探討水體中汞對斑馬魚腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝臟抗氧化指標的影響。

1 試驗材料及方法

1.1 斑馬魚樣品及試驗方法

研究使用成年斑馬魚，購買自中國斑馬魚資源中心（CZRC，http://en.zfish.cn/）。所有斑馬魚都飼養(yǎng)于連續(xù)曝氣的300 L水族箱中，并配備溫度、光照和供氧控制裝置，光周期白天和黑夜比為14 h?10 h，水溫 (25±1) ℃，酸堿度為 (7.0±5)，導電性為850—900 μs·cm-1。斑馬魚氯化汞暴露實驗根據(jù)我們以前的方法進行（Zhanget al.，2020）。首先，在無菌容器中配置0.1%（1 g·L-1）的氯化汞（HgCl2，HGC，Sigma-Aldrich，美國）母液。所有動物實驗完全按照昆明理工大學關(guān)于實驗動物倫理道德和福利的相關(guān)規(guī)定進行（KMUSTA-2019723-01）。將40尾大小相似 (3.8±0.3) cm的成年斑馬魚平均分為2個組（每組20條），分別飼養(yǎng)于兩個獨立水族箱內(nèi)（1.5 L）。HGC暴露實驗組（DRM）的斑馬魚暴露在濃度為30 μg·L-1（采用冷原子熒光法測定水中Hg2+濃度（Wang et al.，2015），Hg2+濃度約為21.3 μg·L-1（Zhanget al.，2020）的HGC。在斑馬魚基因表達、氧化壓力、荷爾蒙和生殖系統(tǒng)等對汞暴露響應(yīng)的條件下，此濃度的氯化汞顯然能對成年斑馬魚腸道及肝組織功能造成影響（Zhanget al.，2016；Zhanget al.，2020）。以往的研究表明：30 μg·L-1氯化汞對成年斑馬魚生殖毒理學相關(guān)指標和腸道基因表達等產(chǎn)生影響，故本研究選取30 μg·L-1的氯化汞作為成年斑馬魚汞暴露濃度（Zhanget al.，2016；Zhanget al.，2020）。此外，不含氯化汞水族箱中的斑馬魚個體作為對照組（DRC）。在飼養(yǎng)24 h后，分別隨機收集處理和對照組中的斑馬魚樣品各15尾。該實驗分別獨立重復3次作為3個生物學重復（處理組：DRM-1、2、3；對照組：DRC-1、2、3）避免單次取樣和斑馬魚個體間引起的隨機及偶然誤差。因本研究僅關(guān)注氯化汞暴露及未暴露組間斑馬魚腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝臟抗氧化酶活間的差異，以期探討汞暴露對斑馬魚腸道菌群結(jié)構(gòu)和肝臟抗氧化指標的影響，故本研究僅設(shè)置了一個斑馬魚汞暴露組。收集后斑馬魚成體置于-80 ℃的超低溫冰箱（Sanyo，日本）。

1.2 DNA提取和PCR擴增

將樣品置于超凈工作臺（蘇坤，中國）進行解剖。分別將每個個體腸道取出，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，用無菌水沖洗3次以去除腸道表面微生物和其中雜質(zhì)。采用TIANamp Stool DNA Kit（天根生物技術(shù)公司，中國）試劑盒，按照說明書進行總DNA抽提。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的特異引物（V1—V9，正向引物：AGRGTTTGATYMTGGCTCAG；反向引物：GGYTACCTTGTTACGACTT、Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（New England Biolabs，英國）和高保真酶混合體系進行16S全長的PCR擴增。PCR產(chǎn)物使用質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒（Qiagen，德國）試劑盒進行膠回收。

1.3 文庫構(gòu)建和上機測序

純化后的16S基因全長采用SMRT Bell Template Prep Kit（Pacific Biosciences，美國）試劑盒進行文庫構(gòu)建：使用DNA黏合酶將測序接頭連接在擴增好的DNA片段兩端，用AMpure PB磁珠對DNA片段進行純化選擇，構(gòu)建SMRT Bell文庫。純化后的片段經(jīng)buffer回溶后，使用BluePipin片段篩選特定大小的片段，并AMpure PB磁珠對DNA片段進行純化。構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit 3.0熒光計（英濰捷基，美國）進行濃度定量，并利用Agilent 2100（安捷倫，美國）確認插入片段長度，隨后用PacBio Sequel（Pacific Biosciences，美國）平臺對6個樣本進行測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理

將PacBio下機數(shù)據(jù)導出bam格式文件。使用Lima軟件根據(jù)barcode序列區(qū)分各樣本的數(shù)據(jù)，所有樣本的序列以bam格式保存。然后使用CCS（SMRT Link v5.0）對序列進行校正，矯正參數(shù)為：CCS=3，最小準確率為0.9，并去除長度小于1 340 bp、最長序列長度大于1 640 bp的序列，以fastq和fasta保存；隨后進行SSR過濾并使用cutadapt去除掉引物，將含有連續(xù)相同堿基數(shù)＞8的序列過濾掉。經(jīng)過以上處理后得到的reads需要進行去除嵌合體序列（http://www.drive5.com/usearch/manual/chimera_formation.html）的處理，reads序列通過（UCHIME Algorithm，http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html）與全長注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean reads）。

利 用Uparse軟 件（Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/）對所有樣品的全部clean reads進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（operational taxonomic units），同時會選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs代表序列進行物種注釋，用Mothur方 法 與SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8—1.0），獲得分類學信息并分別在各個分類水平：kingdom（界）、phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE（Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/）軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。最后，對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準進行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）（Caporasoet al.，2010）計算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ACE，Goods-coverage指數(shù)。Alpha和Beta多樣性指數(shù)組間差異分析均進行有參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗，當滿足參數(shù)假設(shè)條件，則組間兩兩比較選用T-test檢驗；反之，則使用Wilcoxon秩和檢驗測試組間差異的顯著水平，統(tǒng)計分析采用IBM SPSS Statistics 22軟件進行。采用Qiime軟件計算Unifrac距離。使用R語言（Version 2.15.3）vegan軟件包繪制NMDS圖。

1.5 肝臟抗氧化酶活性檢測

解剖收集成年斑馬魚肝臟，后在預(yù)冷勻漿培養(yǎng)基（0.01 M Tris-HCl、0.001 M EDTANa2、0.01 M蔗糖、pH7.4）中研磨，以3 000 r·min-1離心，收集上清液以測定酶活性（劉林等，2015a）。然后將上清液與酶底物孵育，使用UV-8000ST分光光度計（上海元析儀器有限公司）以指定波長讀取。酶活性檢測一式三份。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，E.C.1.11.1.9）、過氧化氫酶（CAT，E.C.1.11.1.6）、超氧化物歧化酶（SOD，E.C.1.15.1.1）、過氧化物酶（POD，E.C.1.11.1.7）活性和丙二醛（MDA）水平，并用作生化指標。商業(yè)檢測試劑盒購自南京建城生物工程研究所（南京，中國，http://elder.njcbio.com/index_en.php），所有酶活性檢測均按照試劑盒說明書測量。采用GSH-Px活性測定試劑盒（目錄號：A005-1-2）測量GSH-Px活性。GSH-Px催化還原型谷胱甘肽還原過氧化氫，在420 nm處檢測其吸光度。使用CAT活性測定試劑盒（目錄號：A007-1-1）測量CAT活性。CAT能催化過氧化氫的分解，鉬酸銨能迅速阻止過氧化氫的分解。剩下的過氧化氫可以很快與鉬酸銨結(jié)合，生成一種淡黃色的絡(luò)合物，可以在405 nm處測量。采用總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測試劑盒（羥胺法）（目錄號：A001-1-2）在550 nm處測定SOD活性。POD活性用過氧化物酶檢測試劑盒（目錄號A084-1-1）測定，POD能催化過氧化氫反應(yīng)；酶活性用420 nm吸光度變化測定。使用丙二醛測定試劑盒（TBA法）（目錄號：A003-1-1）在532 nm的吸收波長下測量丙二醛水平。用總蛋白測定試劑盒（雙辛酸法）（目錄號：A045-4-1）在562 nm處測定粗酶提取物中的可溶性蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)

對兩組實驗的6個斑馬魚腸道菌群測序文庫進行測序，一共得到71 472條原始序列，質(zhì)量控制后，得到69 344高質(zhì)量序列；一共獲得堿基100 717 757 bp，平均長度為1 450 bp。單獨樣品的測序結(jié)果如表1所示。有效序列和原始序列的比值為96.72%。每個樣品詳細數(shù)據(jù)測序數(shù)據(jù)和過濾后數(shù)據(jù)信息見表1。

表1 不同斑馬魚腸道菌群樣品16S rDNA測序基本信息Table 1 Information of 16S rDNA sequencing of different gut flora samples in zebrafish

2.2 斑馬魚腸道菌群Alpha和Beta多樣性分析

NMDS（Stress＜0.001）結(jié)果顯示，實驗組與對照組顯著分開，且各自生物學重復間具有更近的距離（圖1）。本研究通過Alpha多樣性指數(shù)反映微生物群落的豐富度和多樣性。使用Chao 1、ACE指數(shù)反映群落豐富度，使用Shannon、Simpson指數(shù)反映群落多樣性。使用Coverage指數(shù)反應(yīng)群落覆蓋度（表2）。通過對是否暴露于重金屬汞的斑馬魚腸道菌群進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，HGC暴露顯著影響斑馬魚腸道菌群的多樣性（ACE，P=0.004 6；Chao 1，P=0.008 7；Shannon，P=0.017 0；Simpson，P=0.059 0）。這些結(jié)果表明，HGC暴露顯著降低了斑馬魚腸道菌群的多樣性。Coverage指數(shù)均大于0.983，表明測序飽和，所測數(shù)據(jù)充分。

圖1 不同處理樣品NMDS圖Fig.1 NMDS plots for different samples

2.3 腸道菌群組成及優(yōu)勢菌群相對豐度分析

對斑馬魚腸道菌群測序數(shù)據(jù)進行注釋后，得到門、屬等分類單元信息。其中，在門分類單元中，相對豐度最高的為梭桿菌門（Fusobacteria），其次為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、Melainabacteria和酸桿菌門（Acidobacteria） （圖2A）。在屬分類單元中，相對豐度最高的為鯨桿菌屬（Cetobacterium），鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas），芽孢桿菌屬（Bacillus），鏈球菌屬（Streptococcus），鄰單胞菌屬（Plesiomonas），氣單胞菌屬（Aeromonas），Burkholderiaceae，尿素芽胞桿菌屬（Ureibacillus），醋桿菌屬（Acetobacter），腸球菌屬（Enterococcus）（圖2B）。

表2 多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 2 Statistics for diversity indices

為探索HGC暴露對斑馬魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，本研究定義相對豐度前十的菌群為優(yōu)勢菌群，并進一步對其在對照組和HGC處理組間的相對豐度差異進行比較分析。結(jié)果表明：相比于對照組，HGC暴露后，梭桿菌門（P=0.000 0）、變形菌門（P=0.000 2）、厚壁菌門（P=0.015 3）、擬桿菌門（P=0.030 4）、放線菌門（P=0.005 5）、藍藻菌門（P=0.001 9）、浮霉菌門（P=0.000 2）等7個門的相對豐度發(fā)生了顯著變化（表3）。其中，梭桿菌門的相對豐度上升幅度最大，與對照組中未明顯檢測相比其相對豐度上升至處理組中的75%以上；相反，變形菌門的相對豐度下降幅度最大，其在對照組樣品中相對豐度約占75%，而在處理組樣品中卻僅占約20%，約降低了近4倍；同時，厚壁菌門也顯示了顯著的下降幅度，處理組中厚壁菌門細菌僅為對照組中約不足30%。此外，在屬水平，鯨桿菌屬（P=0.000 0）、鞘脂單胞菌屬（P=0.000 2）、芽孢桿菌屬（P=0.006 8）、鏈球菌屬（P=0.011 2）、氣單胞菌屬（P=0.019 6）、尿素芽胞桿菌屬（P=0.016 1）、腸球菌屬（P=0.007 6）等7個屬細菌的相對豐度在斑馬魚HGC暴露下也發(fā)生了顯著改變。其中，鯨桿菌屬、鏈球菌屬和氣單胞菌屬的細菌相對豐度上呈現(xiàn)出顯著的上升幅度，尤其是鯨桿菌屬的細菌上升幅度最大，從對照組中未明顯檢測到上升至處理組中的75%以上；相反，鞘脂單胞菌屬、芽孢桿菌、解脲芽孢桿菌屬和腸球菌屬的細菌相對豐度上呈現(xiàn)出顯著的下降幅度，尤其是鞘脂單胞菌屬的細菌，從對照組樣品中的約70%相對豐度下降至處理組樣品中的低于5%（表4）。

圖2 門（A）、屬（B）水平腸道菌群組成Fig.2 Composition of gut flora at Phyla (A) and Genera (B) level in treatment and control groups

表3 門分類單元下相對豐度前10細菌的變化Table 3 Changes in relative abundance of top10 bacteria phylum taxa

2.4 肝臟抗氧化酶活性

成年斑馬魚HGC暴露后，肝臟抗氧化酶GSH-Px、CAT和SOD活性發(fā)生顯著上升或下降（P＜0.05），而POD活性略有上升，但差異不顯著（P＞0.05）（表5）。另外，相比對照組，HGC暴露組肝臟MDA水平發(fā)生顯著上升（P＜0.05）。具體來看，HGC暴露后，斑馬魚肝組織的GSH-Px活性(41.79±7.11) U·mg-1與對照組的GSH-Px活性(23.61±4.98) U·mg-1相比顯著增高1.77倍；HGC暴露后，斑馬魚肝組織的SOD活性 (74.12±9.32)U·mg-1與對照組的SOD活性 (31.22±6.47) U·mg-1相比顯著升高到了2.37倍；與此同時，MDA水平在斑馬魚HGC暴露前后變化最為劇烈，由(4.71±0.51) nmol·mg-1升 高 到 (31.26± 5.58)nmol·mg-1，升幅高達6.64倍。但通過HGC暴露處理成年斑馬魚后，卻誘發(fā)了肝臟中CAT活性發(fā)生顯著下降由對照組（(132.63±13.87) U·mg-1下降至(53.71±8.16) U·mg-1，2.47倍）。

表4 屬分類單元下相對豐度前10的變化Table 4 Changes in relative abundance of the top10 in genera taxa

表5 汞暴露對斑馬魚肝臟抗氧化酶（谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶）活性和丙二醛水平的影響Table 5 Effect of mercury exposure on the activity of antioxidant enzymes (GSH-Px, CAT, SOD, POD) and MDA levels in zebrafish liver

3 討論

3.1 汞暴露對斑馬魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

本研究通過第三代測序技術(shù)對對照和HGC暴露的斑馬魚腸道菌群進行16S rDNA全長序列進行高通量測序，獲得了一批高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，保證了下游腸道菌群結(jié)構(gòu)分析的可靠性。NMDS分析表明實驗處理恰當，不同處理的生物學重復樣品各自聚在一起，且處理和對照組明顯分開，顯示了斑馬魚腸道菌群在HGC暴露后產(chǎn)生了明顯不同的結(jié)構(gòu)特征。研究結(jié)果進一步顯示對照組斑馬魚腸道菌群多樣性顯著高于HGC暴露組斑馬魚，可見腸道菌群多樣性下降也是菌群結(jié)構(gòu)變化的重要特征之一。此外，利用重金屬銅處理異育銀鯽（Carassius auratus）后，腸道微生物發(fā)生多樣性出現(xiàn)顯著下降（涂宗財?shù)龋?017），而且斑馬魚短期暴露于霜霉威鹽酸鹽時，腸道菌群的多樣性也會發(fā)生顯著下降（Zhanget al.，2018）。這些證據(jù)進一步支持了HGC暴露可以降低斑馬魚腸道菌群的多樣性，腸道菌群多樣性的下降可能是外源環(huán)境的強烈刺激對機體正常生命活動造成的一種損傷機制。當然，這還需要通過降低或提高斑馬魚腸道菌群多樣性后，比較不同腸道菌群多樣性斑馬魚間的行為、生理和生化等指標來進一步確認。另外，斑馬魚腸道菌群多樣性的降低或可作為一個對水環(huán)境污染風險評估的潛在指標。

在門分類水平，梭桿菌門，變形菌門，厚壁菌門為的斑馬魚腸道細菌相對豐度占據(jù)前三，尤其梭桿菌和變形菌占絕大多數(shù)，該研究結(jié)果與以往大部分針對成年斑馬魚腸道菌群的研究結(jié)果相似（Bates et al.，2006；Wonget al.，2015；Zhanget al.，2019），顯示了本研究測序及分析結(jié)果的可靠。同時，斑馬魚暴露于HGC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其腸道優(yōu)勢菌群中的梭桿菌門相對豐度發(fā)生了顯著上升，而變形菌門和厚壁菌門相對豐度發(fā)生了顯著下降，這也進一步表明斑馬魚暴露于HGC后，其腸道菌群在門水平的相對豐度會受到顯著影響。以往研究表明，暴露于高濃度的殺菌劑抑霉唑21 d后，斑馬魚腸道內(nèi)的變形菌門相對豐度顯著下降，而厚壁菌門的豐度顯著上升（Jinet al.，2017），厚壁菌門的變化趨勢同幼年斑馬魚暴露于微塑料7 d后的一致（Wanet al.，2019）。然而，作為常見的重金屬污染物，砷會改變小鼠腸道微生物的組成，造成厚壁菌門的豐度顯著降低（Luet al.，2014）?？梢?，不同水體污染物造成的腸道細菌在門水平類型和變化趨勢上存在較大差異。

在屬分類水平，7個優(yōu)勢細菌屬的相對豐度對斑馬魚HGC暴露發(fā)生了顯著的響應(yīng)，其中鯨桿菌屬、鏈球菌屬和氣單胞菌屬的細菌相對豐度上發(fā)生了顯著上升，鞘脂單胞菌屬、芽孢桿菌、解脲芽孢桿菌屬和腸球菌屬的細菌相對豐度發(fā)生顯著下降，這與涂宗財?shù)龋?017）利用重金屬銅對異育銀鯽腸道處理后鯨桿菌屬和氣單胞菌屬細菌相對豐度發(fā)生顯著上升，芽孢桿菌屬細菌相對豐度發(fā)生顯著下降，具有一定相似性。盡管一些相對豐度顯著改變的細菌的生物學功能尚不清楚，但其中部分細菌類群與代謝、疾病和炎癥密切相關(guān)。例如，鯨桿菌屬是魚類腸道和糞便中的優(yōu)勢菌群（Sylvain et al.，2017），是魚類微生物屏障功能的重要組成部分。當前環(huán)境污染物對魚類腸道鯨桿菌屬類群影響的研究還極為鮮見，本研究首次報道了重要水體重金屬污染物對魚類腸道鯨桿菌屬細菌的影響。不過，在魚類病原菌對魚類腸道菌群影響的研究中已發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilis）感染顯著提高了成年草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道內(nèi)鯨桿菌屬菌群的相對豐度（李東亮，2016）。本研究結(jié)果顯示：當斑馬魚暴露于HGC時，腸道內(nèi)鯨桿菌的相對豐度會顯著增加。這些證據(jù)暗示了鯨桿菌屬相對豐度的增加可能是魚類遭受外源物刺激誘發(fā)的一個腸道細菌標志。此外，鞘脂單胞菌屬是魚類重要的益生菌（余桂娟等，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)鞘脂單胞菌相對豐度在斑馬魚HGC暴露下，豐度顯著降低。芽孢桿菌能對斑馬魚腸道有較好的黏附，具有免疫調(diào)節(jié)和免疫保護作用，能有效刺激斑馬魚腸道黏膜的抗炎反應(yīng)和屏障再生，提高斑馬魚對嗜水氣單胞菌感染的免疫抵抗能力（Wanget al.，2015）。尿素芽胞桿菌和腸球菌在斑馬魚腸道中的角色還鮮有報道，但這兩類細菌已廣泛作為動物腸道益生菌。鏈球菌和氣單胞菌是自然界重要的魚類病原菌，其病害是水產(chǎn)業(yè)的主要威脅之一，斑馬魚已被用于作為鏈球菌和氣單胞菌疾病研究的模型（Neelyet al.，2002；Ayaz Ahmedet al.，2018）。這些證據(jù)表明，水體HGC暴露誘導成年斑馬魚腸道菌群失調(diào)，主要益生菌和病原菌的相對豐度都產(chǎn)生了顯著改變。

3.2 汞暴露對斑馬魚肝臟抗氧化酶的影響

活性氧種類（reactive oxygen species，ROS）和過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）水平由抗氧化防御機制的協(xié)同作用控制，抗氧化酶的活性是氧化應(yīng)激、細胞膜和DNA損傷程度以及過量ROS和H2O2消除的潛在指標（劉林等，2015b；Zhenget al.，2019）。大量的研究顯示水體污染物能引誘機體產(chǎn)生過量的ROS和H2O2，從而損傷器官和組織（Livingstone，2003；Valavanidiset al.，2006）。GSH-PX在CAT含量較低的組織中具有與CAT相似的作用，可以去除H2O2，防止H2O2對組織的氧化損傷（Eliaet al.，2006）。已有大量研究報道了GSH-PX在魚類遭受水體污染物脅迫中的抗氧化防御作用。例如，研究發(fā)現(xiàn)水體中Cu2+暴露能顯著提高銀鯧（Pampus gentareus）幼魚組織中的GSH-PX活性，造成抗氧化防御系統(tǒng)的破壞（周健愷等，2014）。本研究中，斑馬魚HGC暴露前，肝臟中GSH-Px水平較低時具有良好的抗氧化防御作用，然而，HGC暴露后，GSH-PX活性急劇上升，表明汞暴露可促進斑馬魚肝臟中抗氧化酶系統(tǒng)的損傷。

CAT作為清除ROS的第一道防線（Udayangani et al.，2017），且CAT是過氧化物酶體的標志酶，能催化H2O2的分解，從而使細胞免于遭受ROS和H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一（劉林等，2015a）。以前的研究發(fā)現(xiàn)，鉛對鯽魚組織中的CAT活性有一定的抑制作用（成嘉等，2006）；也有研究報道了一種印度的淡水魚Wallago attu在污染水體中，魚體內(nèi)的CAT活性較清潔水體中的低（Pandeyet al.，2003）。CAT活性下降可能是重金屬通過置換出金屬酶活性中的必要金屬或結(jié)合到酶蛋白分子中的巰基、羧基等功能基團而導致的，當機體中抗氧化酶活性受到抑制后，清除自由基能力下降（劉林等，2015a）。在本研究中，與對照組相比，斑馬魚HGC暴露顯著降低了肝組織CAT活性，表明水體汞對斑馬魚肝組織可能造成了氧化損傷。另外，CAT也可能是一種潛在的水環(huán)境汞污染風險評估酶學標志物，顯示了其用于評估汞暴露對魚類肝組織損傷程度的潛力。

SOD在魚類抗氧化酶系統(tǒng)中起重要作用，是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵指示物，早已作為一種酶學標志物用于水環(huán)境污染風險評估（Carla et al.，2002）。SOD維持著機體的氧化（自由基產(chǎn)生）與抗氧化（自由基清除）平衡，它能通過清除超氧陰離子保護機體免受損傷（劉林等，2015a）。在哺乳動物中的研究發(fā)現(xiàn)，當機體受到氧化壓力，生物體內(nèi)會出現(xiàn)比正常情況下多數(shù)倍的SOD來清除過量的氧自由基，避免機體受到氧化損傷（Kellyet al.，1998）。以往研究也報道了納米氧化鋅暴露不同的時間，斑馬魚肝組織中的SOD活性上升3—5倍不等，表明了納米氧化鋅暴露對斑馬魚肝的氧化損傷（劉林等，2015a）。本研究中，HGC暴露導致了斑馬魚肝組織中SOD活性升高，進一步表明汞對斑馬魚的肝組織造成了氧化損傷，而斑馬魚肝組織通過產(chǎn)生更多的SOD阻止或減緩損傷進程。

MDA是脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，是細胞膜系統(tǒng)損傷的重要指標之一，其水平可用于評估組織受損傷程度（Al-Bairutyet al.，2013；劉林等，2015a）。先前的研究表明，汞暴露濃度為15 μ·mL-1時，可導致斑馬魚卵巢內(nèi)的MDA水平顯著上升（Zhanget al.，2016）；劉占才等（2016）也發(fā)現(xiàn)濃度為0.5 μg·mL-1的汞暴露5 d后，草魚腎臟中的MDA水平會出現(xiàn)顯著上升；劉林等（2015a）甚至發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅在水體中濃度超過0.01 μg·mL-1時，就能誘導斑馬魚肝組織中的MDA水平明顯升高，并提出這種現(xiàn)象可能是組織細胞受污染物的脅迫產(chǎn)生過多的自由基，損傷細胞膜膜脂中的不飽和脂肪酸，破壞了細胞膜正常的結(jié)構(gòu)和膜內(nèi)外物質(zhì)交換，從而產(chǎn)生大量的MDA。本研究也顯示了，汞暴露斑馬魚時，其肝組織中的MDA水平上升數(shù)倍，表明汞暴露給斑馬魚肝中的抗氧化酶系統(tǒng)帶來了巨大氧化壓力，破壞了肝組織的正常功能和解毒能力。此外，本研究中，僅在24 h汞暴露后，斑馬魚肝中丙二醛水平就有較大幅度升高，說明汞暴露可在較短時間內(nèi)造成斑馬魚的肝損傷。

4 結(jié)論

（1）本研究首次采用第三代測序技術(shù)及生物信息學分析，研究了重金屬汞暴露前后魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)，并比較了它們之間的差異。研究結(jié)果證實了汞暴露引起斑馬魚腸道菌群多樣性顯著下降，以降低斑馬魚的抗逆能力，這可能是水體污染物損傷魚類的一種潛在機制。

（2）水體汞暴露能使斑馬魚腸道菌群中的梭桿菌門、益生菌鯨桿菌屬、魚類病原菌氣單胞菌屬和鏈球菌屬相對豐度顯著上升；變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍藻菌門、浮霉菌門等6個門，鞘脂單胞菌屬、芽孢桿菌屬、尿素芽胞桿菌屬、腸球菌屬等4個屬腸道益生菌的相對豐度顯著下降。

（3）水體汞暴露能使斑馬魚肝組織中抗氧化酶活性受到影響，引起肝組織中氧化酶及抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生紊亂，導致肝組織受損，且這種損傷在短時間（24 h）內(nèi)即可產(chǎn)生。