決明子總蒽醌對脂多糖誘導大鼠急性肝損傷的作用及其機制探討

（閬中市人民醫(yī)院，四川 閬中 637400）

急性肝損傷（acute liver injury,ALI）是指肝臟疾病發(fā)展至功能衰竭的中間環(huán)節(jié)。我國是肝病高發(fā)國家，其中感染為主要病因，由此導致的脂多糖血癥是造成肝功能損傷的重要因素[1]。在疾病進展中，內毒素可使機體炎癥反應失控，大量的炎癥因子和效應細胞相互激活，引起肝細胞彌漫性壞死[2]。如果不能得到有效控制，可引發(fā)肝纖維化、肝硬化甚至是臟器衰竭危及患者生命，但目前ALI 的病理機制尚未完全闡明[3]。有學者報道肝損傷與高遷移率族蛋白B1（high modility groupbox 1,HMGB1）活化有關，HMGB1 能夠進一步激活Toll 樣受體4（Toll like receptor4,TLR4）、核因子κB（nuclear factor kappaB,NF-κB）通路，通過大量釋放炎癥介質，引起肝損傷[4]。有研究發(fā)現阻斷HMGB1 信號，能有效抑制四氯化碳誘導的肝損傷小鼠肝臟細胞凋亡[5]，但未有明確報道證明HMGB1/TLR4/NF-κB 信通路對脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）誘導大鼠ALI 的保護作用。作為常用中藥材，決明子具有清肝明目的功效，在臨床廣泛使用，有研究發(fā)現，決明子有效成分為蒽醌類化合物[6]。有研究顯示決明子總蒽醌通過對肝細胞增殖與凋亡的影響，促進肝組織再生修復[7]。近期有學者報道決明子總蒽醌能夠抑制NF-κB 通路蛋白的表達，降低炎癥反應[8]。本研究通過復制LPS 誘導的ALI 大鼠模型，探討決明子總蒽醌對大鼠肝臟的作用機制，為臨床提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF 級8 ～10 周齡的SD 雄性大鼠60 只，體重200 ～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0011]。依照閬中市人民醫(yī)院實驗動物管理辦法，室溫下標準飼料、自由飲水、分籠（4 籠）適應性飼養(yǎng)1 周。動物實驗操作均經醫(yī)院實驗動物管理倫理委員會批準（批準號：2019-032）。

1.1.2 主要試劑LPS 購自美國Sigma 公司，決明子總蒽醌由本實驗室提取（批號：20180624），BCA 蛋白測定試劑盒、DAB 化學發(fā)光試劑盒購自南京建成生物有限公司，HMGB1、TLR4 及NF-κB 抗體購自德國Rebstock 公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）、白細胞介素-1β（Interleukin 1β,IL-1β）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器LIOOS600T 生物顯微鏡購自日本尼康公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司，-80℃超低溫冰箱購自德國維根斯公司，RM2135 組織切片機購自德國Leica 公司，高速低溫離心機購自北京六一儀器廠。

1.2 模型復制和分組

大鼠均適應性喂養(yǎng)7 d，隨機分為對照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組12 只。除對照組外其余各組大鼠尾部靜脈注射5 mg/kg LPS 復制ALI 模型，注射劑量0.5 ml；對照組給予同等體積的生理鹽水[9]。低、中、高劑量組大鼠在模型復制后每日分別給予灌胃1 次10 mg/kg、20 mg/kg 及40 mg/kg的決明子總蒽醌，灌胃劑量5 ml，連續(xù)給藥14 d；對照組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.3 血清生化指標檢測

實驗第15 天清晨抽取大鼠空腹尾部靜脈血，4℃、5 000 r/min 離心10 min，取上層血清，4 h 內采用全自動生化儀檢測各組大鼠肝功能指標，包括丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransfease,ALT）、總膽紅素（total bilirubin,TBIL）及天門冬氨酸基轉移酶（aspartate aminotransferase,AST）。

1.4 HE 染色觀察肝組織病理變化

采血后引頸處死大鼠，沿腹中線切開腹壁，暴露腹腔組織，小心分離肝臟，采用10%多聚甲醛固定24 h 后切片，HE 染色后光鏡下觀察其病理改變。

1.5 TUNEL 染色檢測各組大鼠肝組織中的細胞凋亡

從冰箱中取出10%大鼠肝組織，常規(guī)方法固定，冷凍切片，二甲苯浸洗2 次，梯度酒精浸洗5 min，風干后用3%雙氧水-甲醇浸泡10 min，PBS 漂洗3 次，3 min/次。采用4℃乙醇預冷的0.1% TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS 漂洗3 次，3 min/次，加入TUNEL 反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，溫度37℃。采用PBS 漂洗，二甲苯處理并用中性樹脂封片后，顯微鏡下觀察各組大肝細胞凋亡情況。

1.6 ELISA 檢測TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平

取肝臟組織并用勻漿器打碎，4℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用ELISA 試劑盒檢測肝組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行，用酶標儀記錄光密度值，并根據標準曲線計算各因素水平。

1.7 Western blotting 檢測HMGB1、TLR4 及NF-κB蛋白

取大鼠部分肝組織，加入RIPA 組織裂解液，勻漿器打碎，4℃、8 000 r/min 離心10 min，取上清液提取總蛋白并定量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，然后在95℃或更高溫度下變性10 min。將樣品加入SDS-PAGE 膠樣品孔中。膜轉移后用2% BSA 密封過夜。用TBST 清洗4 次后，在4℃條件下用一級抗體孵育過夜，TBST 清洗4 次后，將二級抗體在37℃條件下孵育1 h，TBST 清洗4 次，反應30 s 后顯影，在成像系統(tǒng)進行曝光和圖像采集，并以GAPDH 作為內參蛋白計算蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝功能的影響

各組ALT、AST 及TBIL 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組較對照組升高（P＜0.05），中、高劑量組較模型組下降（P＜0.05）。決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝功能的保護具有劑量依賴性。見表1。

表1 各組ALT、AST 及TBIL 水平比較 （n=12，±s）

表1 各組ALT、AST 及TBIL 水平比較 （n=12，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05，②與模型組比較，P＜0.05。

組別 ALT/（u/L） TBIL/（μmol/L） AST/（u/L）對照組 42.30±6.49 9.05±3.42 142.26±15.63模型組 240.68±9.27① 43.49±2.71① 343.55±16.54①低劑量組 234.12±7.59 41.92±2.32 340.46±14.63中劑量組 154.41±5.06② 24.40±3.25② 238.72±13.85②高劑量組 88.98±4.81② 14.51±3.01② 201.82±12.61②F 值 153.232 182.532 128.458 P 值 0.000 0.000 0.000

2.2 決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝臟的影響

對照組大鼠肝臟細胞結構完整，清晰可辨；細胞整齊排列，細胞間質無水腫，肝臟橫紋清晰且規(guī)則。模型組大鼠肝臟細胞腫脹且排列不規(guī)則；細胞間質水腫明顯及細胞外基質增多，可見較多炎癥細胞浸潤，成纖維細胞增多。低劑量組大鼠肝臟細胞排列更加紊亂，部分核膜破裂、消失，可見部分細胞胞膜缺失，細胞呈現凋亡狀態(tài)，肝臟細胞間質充血嚴重，肝臟橫紋消失，出現炎癥細胞浸潤。與模型組相比，中、高劑量組大鼠肝臟細胞較模型組排列規(guī)則，炎癥細胞浸潤明顯減少，肝臟細胞損傷癥狀明顯減輕，細胞凋亡狀態(tài)明顯改善，并呈劑量依賴性。見圖1。

2.3 決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝臟細胞凋亡的影響

對照組、模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組肝細胞凋亡率分別為（12.76±1.39）%、（79.26±6.97）%、（75.51±4.22）%、（61.41±2.48）%和（47.87±8.29）%，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=56.384，P=0.000）；模型組較對照組升高（P＜0.05），中、高劑量組較模型組下降（P＜0.05）。決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝細胞凋亡的抑制作用具有劑量依賴性。見圖2。

圖1 決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝臟的影響 （HE×200）

圖2 決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝臟細胞凋亡的影響 （TUNEL 染色×400）

2.4 決明子總蒽醌對ALI 大鼠IL-1β、IL-6 和TNF-α 的影響

各組肝組織中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組較對照組升高（P＜0.05），中、高劑量組較模型組下降（P＜0.05）。決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝臟炎癥因子水平的抑制作用具有劑量依賴性。見表2。

表2 各組肝組織中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比較 （n=12，pg/ml，±s）

表2 各組肝組織中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比較 （n=12，pg/ml，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05，②與模型組比較，P＜0.05。

組別 IL-6 IL-1β TNF-α對照組 61.18±6.62 20.92±1.40 156.45±5.45模型組 336.61±14.29① 58.90±6.35① 632.16±14.57①低劑量組 330.68±4.14 55.49±3.79 623.37±10.02中劑量組 221.77±9.45② 41.92±4.00② 377.85±15.33②高劑量組 138.44±4.37② 32.26±4.13② 288.44±6.72②F 值 192.515 32.394 168.302 P 值 0.000 0.000 0.000

2.5 決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白表達的影響

各組肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組較對照組升高（P＜0.05），中、高劑量組較模型組下降（P＜0.05）。決明子總蒽醌對ALI 大鼠肝臟HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白的調控作用具有劑量依賴性。見表3 和圖3。

表3 各組肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相對表達量比較 （n=12，±s）

表3 各組肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相對表達量比較 （n=12，±s）

注：①與對照組相比，P＜0.05，②與模型組相比，P＜0.05。

組別 HMGB1 TLR4 NF-κB對照組 0.96±0.08 0.97±0.07 0.98±0.07模型組 3.90±0.28① 4.60±0.13① 2.66±0.24①低劑量組 3.79±0.21 4.50±0.18 2.54±0.19中劑量組 2.89±0.33② 2.88±0.29② 1.98±0.23②高劑量組 2.32±0.18② 2.36±0.18② 1.58±0.10②F 值 20.482 23.434 13.523 P 值 0.002 0.000 0.003

圖3 肝組織中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白的表達

3 討論

ALI 可由多種因素引起，是以肝功能迅速惡化為臨床特點的急性綜合征，影響肝臟的解毒、生物轉化和排泄等功能，嚴重者會出現肝臟大面積壞死直至衰竭[10]。ALI 病死率較高，給患者家庭及社會造成沉重負擔，如何治療ALI 仍是臨床醫(yī)學中具有挑戰(zhàn)的課題之一。因此研究ALI 的發(fā)病機制，探索新的治療藥物和方法具有重要的臨床價值。

現代藥理學研究表明，決明子具有良好的抗炎、抗纖維化、降血壓、抗氧化等多種生物學功能[11]。有研究發(fā)現，決明子總蒽醌能明顯降低免疫性肝損傷大鼠肝組織炎癥因子的表達水平[12]。MENG 等[13]研究證實，決明子總蒽醌能影響血清中CTGF 和TGF-β1的含量，改善慢性肝衰竭大鼠的肝功能。有報道稱，決明子總蒽醌能明顯抑制病毒感染大鼠的肝組織纖維化[14]。有學者通過構建四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠模型發(fā)現，大鼠經決明子總蒽醌治療后肝臟組織中凋亡蛋白水平降低，免疫系統(tǒng)被激活，炎癥細胞浸潤明顯好轉[15]。以上結果提示決明子總蒽醌對多種原因引起的肝細胞凋亡能起到保護作用。然而決明子總蒽醌在LPS 誘導ALI 中的研究目前少有報道。本研究發(fā)現，與對照組相比，模型組大鼠肝功能明顯降低，肝臟細胞腫脹變形，并可見較多炎癥細胞浸潤，肝臟組織細胞凋亡數目明顯增多。經過決明子總蒽醌處理后，與模型組相比，肝臟病理改變明顯，肝細胞凋亡受到明顯抑制，呈劑量依賴性。

有研究發(fā)現，ALI 伴有大量的炎癥細胞浸潤，肝上皮細胞通透性在逐級放大的炎癥反應中增強，最終引起肝組織纖維化和肝水腫[16]。IL-1β、IL-6 和TNF-α 作為反映炎癥水平的重要因子，在誘導肝衰竭過程中發(fā)揮重要作用[17]。本研究結果顯示，經決明子總蒽醌治療后的ALI 大鼠肝組織中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平明顯降低。說明決明子總蒽醌可以有效降低LPS 誘導ALI 大鼠肝臟的炎癥水平。HMGB1、TLR4 及NF-κB 是與炎癥相關的重要信號通路，有學者研究發(fā)現外周血中HMGB1 水平升高，會伴有炎癥癥狀加重，HMGB1 與炎癥介質相互作用構成免疫刺激復合物是促進這一過程的重要機制[18]。另有文獻報道HMGB1 可通過TLR4 信號通路調控非酒精性肝損傷大鼠炎癥反應，TLR4 在HMGB1 調控下，其下游磷酸化水平升高，進而活化NF-κB，而NF-κB 蛋白與細胞炎癥反應及其凋亡作用密切相關[19]。本研究結果顯示，模型組大鼠HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相對表達量明顯升高，中、高劑量組大鼠HMGB1、TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量降低，提示決明子總蒽醌可能通過HMGBA 介導TLR4、NF-κB 通路，對LPS 誘導的ALI 發(fā)揮保護作用。

綜上所述，決明子總蒽醌可以抑制LPS 誘導ALI模型大鼠的HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路的激活，從而減輕對臟器的損害，改善肝功能。但決明子總蒽醌是否還能通過調節(jié)其他信號通路發(fā)揮作用，以及如何將決明子總蒽醌應用于ALI 患者的臨床治療，仍需進一步研究。