口腔鱗狀細(xì)胞癌患者唾液microRNA-342和Naa10p表達(dá)與頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的關(guān)系

淦岷，王永武，王麗，陸偉，段青云

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 口腔科，浙江 杭州 310006；2.杭州市丁橋醫(yī)院 口腔科，浙江 杭州 310022）

頸部淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移是頭頸外科惡性腫瘤研究的重點(diǎn)，尤其是對(duì)臨床檢查陰性（cN0）者進(jìn)行頸淋巴結(jié)清掃一直存有爭(zhēng)議[1]。黃建瑤等[2]學(xué)者報(bào)道cN0期口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous carcinoma,OSCC）患者側(cè)頸部淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移率約為28.1%。目前臨床頸部隱匿性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)多為有創(chuàng)性，包括超聲引導(dǎo)下針吸細(xì)胞學(xué)檢查、正電子發(fā)射體層攝影術(shù)、前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)等，由于其對(duì)臨床經(jīng)驗(yàn)和檢測(cè)技術(shù)要求較高，而且費(fèi)用昂貴，因此難以在全國(guó)范圍內(nèi)開(kāi)展[3]。目前與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子生物學(xué)有望為臨床無(wú)創(chuàng)檢測(cè)提供新的方法和思路。Naa10p 屬于N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，其作用靶點(diǎn)眾多、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)[4]。microRNA-342（miR-342）位于14 號(hào)染色體編碼Enah/Vasp 樣蛋白的內(nèi)含子上，對(duì)舌癌、肝癌等的轉(zhuǎn)移都有一定影響，關(guān)于miR-342 在OSCC 中的研究尚少。本研究旨在探討OSCC 患者唾液中miR-342 表達(dá)和Naa10p 水平與臨床病理特征和頸部淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的關(guān)系，旨在為OSCC 的臨床診斷和個(gè)體化治療提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年5月—2019年12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院接受原發(fā)灶擴(kuò)大切除術(shù)及頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)的OSCC 患者85 例作為OSCC 組。OSCC 組男性57 例，女性28 例；年齡28 ～76 歲，平均（56.01±11.78）歲；舌癌37 例，牙齦癌23 例，頰黏膜癌12 例，口底癌8 例，硬腭癌5 例；經(jīng)術(shù)中或術(shù)后病理檢查確診為頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移者35 例。同期于本院就診的30 例癌前病變患者作為癌前病變組，其中男性18 例，女性12 例；年齡18 ～79 歲，平均（57.37±14.56）歲；口腔扁平苔癬患者14 例，口腔白斑患者11 例，口腔紅斑者3 例，慢性潰瘍長(zhǎng)期不愈者2 例。隨機(jī)選擇同期于本院體檢的健康志愿者30例作為對(duì)照組，經(jīng)口腔檢查確診無(wú)口腔黏膜或牙周黏膜疾病，全身檢查無(wú)系統(tǒng)性疾病。其中男性15 例，女性15 例；年齡22 ～80 歲，平均（59.23±16.71）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌；②首次確診；③術(shù)前未經(jīng)放、化療及其他抗腫瘤治療；④術(shù)前臨床資料完整，經(jīng)捫診、影像學(xué)（CT、MRI）檢查未發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，確診為cN0。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、急慢性感染、嚴(yán)重肝和腎功能障礙、心腦血管疾病或其他有可能干擾miR-342 表達(dá)、Naa10p 水平表達(dá)者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且與所有研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 唾液標(biāo)本采集采集OSCC 組術(shù)前，癌前病變組確診時(shí)及對(duì)照組入組時(shí)和晨起唾液標(biāo)本，采集前需用清水漱口5 min。收集2 份未經(jīng)刺激的唾液標(biāo)本各2 ml，室溫下離心，將清亮唾液保存至無(wú)菌樣本管中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 qRT-PCR采用Trizol 法抽提唾液上清液總RNA。采用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，miR-342 莖環(huán)引物序列為：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC GAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGCC-3'，長(zhǎng)度45 bp；內(nèi)參小分子U6 snRNA 引物序列為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，長(zhǎng)度47 bp。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，冰浴中配制20μl PCR 反應(yīng)體系，包括2×SsoAdvanced SYBR Green Supermix 10μl，cDNA 模板2μl，正反向引物各1μl，加入dd H2O 水適量。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)，60℃繼續(xù)延伸5 min。將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，計(jì)算循環(huán)閾值。以2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 唾液Naa10p 檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，先配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液，治療濃度分 別 為2 000.00 pg/ml、1 000.00 pg/ml、500.00 pg/ml、250.00 pg/ml、125.00 pg/ml、62.50 pg/ml、31.25 pg/ml及0.00 pg/ml，檢測(cè)酶標(biāo)儀450 nm 處的光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另采用同樣步驟檢測(cè)樣本的光密度值，計(jì)算其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度。

1.3 試劑和儀器

Naa10p 酶聯(lián)試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司（檢測(cè)范圍31.25 ～2 000 pg/ml，檢測(cè)限：9.64 pg/ml，重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)＜10%，板間變異系數(shù)＜15%）。Trizol LS 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，mirVana PARIS Kit 購(gòu)自美國(guó)Ambion 公司，One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit 和SYBR Green PCR master Mix 購(gòu)自日本TaKaRa 公司，酶標(biāo)儀、iQ5 Realtime PCR System 購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。繪制ROC 曲線，影響因素的分析采用多因素Logistic 回歸模型，相關(guān)性分析用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較

各組唾液中miR-342 表達(dá)及Naa10p 水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；癌前病變組和OSCC 組miR-342 表達(dá)較對(duì)照組降低，Naa10p 水平較對(duì)照組升高（P＜0.05）。另外，OSCC組miR-342 表達(dá)較癌前病變組降低，Naa10p 水平較癌前病變組升高（P＜0.05）。各組年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 OSCC 患者唾液miR-342 與Naa10p 蛋白的相關(guān)性

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析，OSCC 患者唾液miR-342與Naa10p 蛋白呈負(fù)相關(guān)（r=-0.693，P=0.000）。見(jiàn)圖1。

2.3 OSCC 患者唾液miR-342 表達(dá)及Naa10p水平與臨床病理特征的關(guān)系

不同腫瘤生長(zhǎng)方式、腫瘤直徑及是否發(fā)生頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的OSCC 患者唾液miR-342 表達(dá)及Naa10p 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 OSCC 患者唾液miR-342 與Naa10p 蛋白的相關(guān)性散點(diǎn)圖

表2 OSCC 患者臨床病理特征與唾液miR-342、Naa10p 相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系 （±s）

表2 OSCC 患者臨床病理特征與唾液miR-342、Naa10p 相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系 （±s）

臨床特征 n miR-342 t/F 值 P 值 Naa10p 蛋白/（pg/ml） t/F 值 P 值性別男57 0.73±0.26 1.037 0.303 307.49±159.64 0.654 0.515女28 0.79±0.23 283.74±152.53年齡≤50 歲 26 0.81±0.24 1.376 0.173 313.62±168.31 0.542 0.589＞50 歲 59 0.73±0.25 293.52±152.59原發(fā)灶部位舌癌 37 0.73±0.25 0.323 0.862 307.63±171.16 0.063 0.993牙齦癌 23 0.76±0.26 297.37±153.32頰黏膜癌 12 0.72±0.27 295.18±148.74口底癌 8 0.83±0.24 278.19±152.02硬腭癌 5 0.78±0.24 296.44±143.61分化程度高-中分化 54 0.76±0.25 0.525 0.601 297.70±158.11 0.152 0.880低-未分化 31 0.73±0.26 303.10±157.09生長(zhǎng)方式外生型 45 0.78±0.24 3.923 0.024 266.83±145.80 4.784 0.011潰瘍型 28 0.78±0.27 301.86±175.06浸潤(rùn)型 12 0.57±0.15 417.71±89.06腫瘤直徑T1（＜2 cm） 24 0.94±0.17 42.008 0.000 200.69±118.73 19.276 0.000 T2（2～4 cm） 43 0.77±0.20 290.84±121.53 T3/4（＞4 cm） 18 0.44±0.11 452.72±164.41頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移否50 0.83±0.24 3.778 0.000 259.85±135.27 2.921 0.005是35 0.64±0.21 356.56±169.49

2.4 OSCC 患者唾液miR-342 和Naa10p 對(duì)頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值

經(jīng)ROC 曲線分析，唾液miR-342 和Naa10p 蛋白診斷OSCC 患者頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的截?cái)嘀捣謩e為0.595、386.10 pg/ml，敏感性分別為80.00%（95% CI：0.670，0.888）和78.00%（95% CI：0.648，0.872），特異性分別為54.29%（95% CI：0.382，0.695）和42.86%（95% CI：0.280，0.571），AUC 分別為0.720（95% CI：0.614，0.827）和0.662（95% CI：0.546，0.778），唾液miR-342對(duì)頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的診斷效能高于唾液Naa10p 蛋白，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=7.145，P=0.000）。見(jiàn)圖2。

2.5 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的多因素Logistic 回歸分析

以頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移作為因變量，將性別、年齡、原發(fā)灶部位、腫瘤分化程度、生長(zhǎng)方式、腫瘤直徑、miR-342 及Naa10p 納入回歸方程進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析（α入=0.05），結(jié)果顯示：腫瘤浸潤(rùn)型生長(zhǎng)方式、腫瘤直徑＞4 cm（T3/4期）和唾液Naa10p蛋白＞386.10 pg/ml 為OSCC 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），而唾液miR-342 ≥0.595 為OSCC頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的保護(hù)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

圖2 唾液miR-342、Naa10p 蛋白診斷OSCC 患者頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的ROC 曲線

表3 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的多因素Logistic 回歸分析參數(shù)

3 討論

手術(shù)是OSCC 最主要的治療方式之一，由于頭頸部的淋巴引流十分復(fù)雜，因此精確評(píng)估頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)于選擇合理的手術(shù)方式，以及療效判斷、預(yù)后評(píng)估都具有重要的臨床價(jià)值[5]。但是目前尚缺乏有效的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法可準(zhǔn)確判斷頸部淋巴結(jié)的隱匿性轉(zhuǎn)移灶，是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和患者預(yù)后較差的主要原因[6]。韓尚志等[7]通過(guò)回顧性分析111 例cN0OSCC 患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移率為27.03%。胡馨元等[8]也證實(shí)，OSCC 頸部淋巴結(jié)的隱匿性轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究共納入了85 例接受原發(fā)灶擴(kuò)大切除術(shù)及頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)的cN0原發(fā)性O(shè)SCC 患者，其中35 例（41.18%）患者發(fā)生隱匿性轉(zhuǎn)移，與其他文獻(xiàn)中的流行病學(xué)數(shù)據(jù)大致一致[7-8]。

近些年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于RNA的生物標(biāo)志物包括編碼和非編碼RNAs 逐漸被證實(shí)可用于惡性腫瘤的篩查和診斷[9]。Naa10p 屬于N-乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白NatA 唯一具有催化活性的亞基之一，通過(guò)催化腫瘤相關(guān)基因發(fā)生乙?；虿灰蕾囉谝阴；膮f(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制活性，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[10]。鄭軍等[11]通過(guò)Envision TM 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，證實(shí)OSCC 黏膜組織中Naa10p 蛋白的表達(dá)水平較白斑組織及正常黏膜組織均顯著升高，并且與原發(fā)灶TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化程度密切相關(guān)。目前血清、組織、糞便等都屬于常用的用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的重要介質(zhì)，但是筆者考慮到OSCC 位置特殊，與唾液密切接觸，唾液中含有大量唾液腺腺體細(xì)胞分泌的酶類、激素、抗體等，以及腫瘤組織中滲出的細(xì)胞因子，而且樣本采集方便、便于運(yùn)輸和保存等，因此在本研究中，筆者選擇檢測(cè)唾液中miR-342 和Naa10p。結(jié)果顯示，Naa10p 在OSCC 患者唾液中的含量高于癌前病變患者和健康對(duì)照人群，這與鄭軍等[11]在OSCC 黏膜組織中的檢測(cè)結(jié)果基本一致。另外，WANG 等[12]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上調(diào)miR-342 表達(dá)可靶向調(diào)控急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞Kg1a 和HL60 中Naa10p基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。SONG 等[13]也發(fā)現(xiàn)miR-342 在OSCC 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程具有類似抑癌基因的活性，可作為OSCC 診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。在本研究中，OSCC 患者唾液中miR-342 相對(duì)表達(dá)量較癌前病變患者和健康對(duì)照人群顯著降低，而且與唾液中Naa10p 蛋白呈負(fù)相關(guān)。

除此以外，唾液中miR-342 表達(dá)、Naa10p 蛋白水平均與原發(fā)灶生長(zhǎng)方式、腫瘤直徑和頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。惡性腫瘤具有呈三維方向侵襲周圍組織的形態(tài)學(xué)特征，韓尚志等[14]認(rèn)為浸潤(rùn)型OSCC 患者發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的的風(fēng)險(xiǎn)較外生型和潰瘍型更高。MELCHERS 等[15]則證實(shí)原發(fā)灶浸潤(rùn)深度＞4.00 mm 可作為判斷早期口腔癌（pT1cN0）頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨界閾值。Naa10p 與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1具有協(xié)同作用，以不依賴乙?；钚缘姆绞酱龠M(jìn)下游E-cadherin等抑癌基因CpG 島甲基化，進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。而miR-342 也可以靶向DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。另外，唾液中miR-342 和Naa10p 蛋白可作為頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的重要診斷指標(biāo)。唾液Naa10p 蛋白＞386.10 pg/ml 可視為評(píng)估OSCC 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而唾液miR-342 ≥0.595 可視為評(píng)估OSCC 頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的獨(dú)立保護(hù)因素。唾液miR-342 對(duì)頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的診斷效能較Naa10p 蛋白更敏感，AUC＞0.7?？紤]到本研究納入的樣本量偏少，不可避免會(huì)出現(xiàn)一定的假陽(yáng)性結(jié)果，這也是本研究的主要缺陷。但是無(wú)論如何，唾液miR-342 和Naa10p 蛋白表達(dá)差異對(duì)OSCC 患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移確實(shí)有一定的預(yù)警價(jià)值，而且與患者腫瘤直徑和腫瘤生長(zhǎng)方式也有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，OSCC 患者唾液miR-342 表達(dá)降低，Naa10p 蛋白水平升高，且兩者具有靶向調(diào)控關(guān)系，唾液中miR-342 和Naa10p 表達(dá)與頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為早期診斷的潛在指標(biāo)。對(duì)于唾液Naa10p 蛋白＞386.10 pg/ml 且唾液miR-342＜0.595 的OSCC 患者，建議進(jìn)行淋巴結(jié)清掃術(shù)，以免二次手術(shù)或頸部腫瘤復(fù)發(fā)。