毒理學(xué)實驗教學(xué)中3R原則的應(yīng)用探索*

王取南，趙玲俐，孫美芳，高 藍(lán)，張 程，王 華，張 君，徐德祥

[安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系(環(huán)境毒理學(xué)安徽高校省級重點實驗室)，安徽 合肥 230032]

毒理學(xué)研究主要以體外研究、整體動物實驗和人體觀察相結(jié)合為主要手段。在研究過程中常常會使用大量動物。如何盡可能減少實驗動物數(shù)量，減少實驗動物的痛苦，并充分利用每只動物，是每個毒理實驗需要關(guān)注的內(nèi)容。毒理學(xué)中的“3R”原則指“優(yōu)化”(refinement)實驗方法和技術(shù)，“減少”(reduction)受試動物數(shù)量和痛苦和“替代”(replacement)整體動物試驗?zāi)Ｊ?。通過3R原則，可明顯減少動物的使用量[1]。以“3R”實驗為導(dǎo)向設(shè)計的實驗方法被定義為毒理學(xué)替代法。例如，傳統(tǒng)的LD50檢測方法需要使用大量的動物，以“3R”原則為導(dǎo)向設(shè)計的“固定計量法”、急性毒性分級法、上下法等可以使動物使用量大大減少[2]。但是，在本科生實驗教學(xué)中，“3R”原則還沒有真正落實，仍然存在使用實驗動物數(shù)量過多和動物利用不充分的問題。

1 毒理學(xué)實驗教學(xué)中存在的一些問題及解決路徑

在本科毒理學(xué)實驗教學(xué)中，一般開設(shè)的實驗課程需要用到不少實驗動物，如染毒方法、生物材料采集、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗和精子畸形試驗。除教師示教用小鼠外，每次每位學(xué)生至少使用1只小鼠，一般情況還得多準(zhǔn)備若干只小鼠備用。

每次課程有其特定的有限教學(xué)目的，小鼠也只能發(fā)揮較單一的作用。例如“生物材料采集實驗”，主要目的是要求學(xué)生掌握小鼠臟器的位置和摘取方法，并計算部分臟器的臟器系數(shù)；“微核實驗”每次都用同樣的樣品處理小鼠，并且在小鼠剖殺后，只取胸骨，擠出骨髓涂片染色觀察，其它臟器不被有效利用；精子畸形實驗中，剖殺前35 d給藥，剖殺時只使用了附睪尾，處理時間長，利用率低。為防止污染，備用小鼠在課程結(jié)束后不能再放回鼠房，通常使用頸椎脫臼處死[3]。

實驗課程可以像科研課題那樣，選定某特定化學(xué)物，針對特定科學(xué)問題，合理設(shè)計，將一些傳統(tǒng)單項實驗課程進(jìn)行合理整合，這樣就能通過一次實驗課達(dá)到傳統(tǒng)單項課程多次課的實驗教學(xué)目的，大大提高教授學(xué)生基礎(chǔ)毒理實驗知識和訓(xùn)練基本實驗技能的課程效率，還可以優(yōu)化實驗流程、方法和技術(shù)，減少使用動物數(shù)量，用生物材料的檢測替代整體動物實驗，實現(xiàn)“3R”原則。因為是類似科研課題的教學(xué)實驗設(shè)計，還可以引導(dǎo)學(xué)生利用專業(yè)知識解決實際問題或科學(xué)問題，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新力。

在安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院2015級食品質(zhì)量與安全專業(yè)的本科生實驗中展開了試點。受試物為鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)。

2 以“3R”原則為導(dǎo)向的實驗教學(xué)試點

2.1文獻(xiàn)檢索 DEHP是塑料中含量較高的一種塑化劑，以非共價結(jié)合方式存在于塑料中，很容易轉(zhuǎn)移到環(huán)境中。生活中，常用的塑料制品如水杯、碗筷和包裝袋等都含有DEHP，并能夠轉(zhuǎn)移到飲料、飯菜和零食里，進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生毒性作用，屬于食品毒理學(xué)范疇。為了解DEHP的相關(guān)毒性作用，首先布置學(xué)生進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)檢索和閱讀，認(rèn)識到DEHP有抗雄激素和擬雌激素作用，是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，且具有生殖毒性、發(fā)育毒性和致癌作用；然后引導(dǎo)學(xué)生針對DEHP的毒性作用特點，分析和提出一些小的科學(xué)問題并設(shè)計相應(yīng)的解決方案，進(jìn)行大學(xué)生創(chuàng)新研究設(shè)計。

2.2小科學(xué)問題的提出和解決方案分析 (1)與非遺傳毒性致癌物不同，遺傳毒性致癌物通常具有致突變性。DEHP是否有致突變作用？致突變作用是發(fā)生在體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞中呢？本科生實驗中的“小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗”是用于檢測DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑的致突變性檢測方法，可檢測外源化學(xué)物對體細(xì)胞的致突變性；“小鼠精子畸形”實驗可以反映雄性生殖毒性，陽性結(jié)果還提示受試物可能具有生殖細(xì)胞致突變性。(2)DEHP是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，是否會影響動物血清中的性激素水平？可以通過麻醉下經(jīng)眼內(nèi)眥取血方法，保留血液樣品，制備血清超低溫保存?zhèn)溆?，后期用ELISA法檢測激素水平，獲得DEHP影響內(nèi)分泌的血清學(xué)證據(jù)。(3)具有內(nèi)分泌干擾特性的DEHP是否影響組織器官性激素受體表達(dá)？小鼠麻醉取血后脫頸處死，摘取各臟器，部分多聚甲醛固定備后期冰凍切片用于性激素受體的免疫組織化學(xué)；部分超低溫保存，后期勻漿提取蛋白和核酸，用于Western-blotting和RT-qPCR檢測性激素受體蛋白和mRNA的表達(dá)水平。

2.3實驗方法的選擇和設(shè)計 (1)實驗教學(xué)項目：課堂教學(xué)完成實驗動物生物材料的采集、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗和小鼠精子畸形制片；課后有興趣的學(xué)生跟隨碩士研究生進(jìn)行ELISA法檢測激素水平，激素受體的免疫組化、Western-blotting和RT-qPCR等拓展項目。(2)染毒方法：因為“小鼠精子畸形”實驗從給藥到剖殺耗時較長，且教學(xué)中主要訓(xùn)練學(xué)生制片方法，因此依據(jù)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗的急性染毒進(jìn)行。小鼠禁食后，根據(jù)雌雄各半的原則和按體重半隨機(jī)分組法分為5組，包括陽性對照組，腹腔注射環(huán)磷酰胺；陰性對照組，灌胃給予不加DEHP的乳糜制劑；低、中、高劑量組，灌胃給予不同劑量的DEHP乳糜制劑。提前24 h給藥1次。(3)實驗流程：給藥24 h后，稱體重，麻醉下經(jīng)眼內(nèi)眥取血，常規(guī)制備血清，超低溫保存?zhèn)溆?。完成取血后，脫頸處死小鼠，胸骨骨髓涂片行微核試驗，取附睪尾行精子制片備后續(xù)染色觀察，摘取各臟器稱重，部分多聚甲醛固定備用，部分先液氮速凍，后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4實驗結(jié)果 傳統(tǒng)教學(xué)中，實驗動物生物材料采集、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗和小鼠精子畸形是單獨開設(shè)的三次實驗課，試點試驗課通過優(yōu)化實驗設(shè)計和流程，將它們整合為一次課程，落實了3R原則中的“優(yōu)化”原則；實驗動物數(shù)量只需要傳統(tǒng)課程需要量的三分之一，節(jié)約了三分之二的實驗動物，體現(xiàn)了3R原則中“減少”的應(yīng)用(表1)；部分同學(xué)基于試點試驗，申請DEHP環(huán)境內(nèi)分泌干擾作用機(jī)制的創(chuàng)新研究項目，直接利用保存的生物材料樣品，代替整體動物實驗，實現(xiàn)了3R原則中“替代”的應(yīng)用。

表1 傳統(tǒng)實驗與試點實驗的對比

通過本次實驗，在完成既定教學(xué)任務(wù)基礎(chǔ)上，學(xué)生初步了解了科學(xué)研究的一般過程，了解了毒理學(xué)中實驗項目和方法的系統(tǒng)設(shè)計原則，懂得了陽性對照和陰性對照的設(shè)計意義。學(xué)生后續(xù)完成了小鼠精子染色觀察，部分學(xué)生跟隨研究生進(jìn)行了后續(xù)的形態(tài)學(xué)實驗(免疫組化)和分子生物學(xué)實驗，培養(yǎng)了學(xué)生的科研興趣，激發(fā)了學(xué)生的科研熱情，部分學(xué)生組隊申請了大學(xué)生創(chuàng)新研究項目。

3 總結(jié)與展望

本次試點，實驗動物的使用從單純的基礎(chǔ)學(xué)習(xí)，轉(zhuǎn)化為在完成基礎(chǔ)知識學(xué)習(xí)的同時，實現(xiàn)小的科學(xué)研究。這種轉(zhuǎn)化不僅充分利用實驗動物，貫徹了“3R”原則，還提升了學(xué)生們的創(chuàng)新科學(xué)思維，為他們將來可能經(jīng)歷的科研道路做了鋪墊。

在毒理學(xué)實驗中還有一些可以轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)學(xué)習(xí)與科學(xué)研究共同進(jìn)行的實驗?；A(chǔ)學(xué)習(xí)為科學(xué)研究提供了實驗操作的基礎(chǔ)，而科學(xué)研究提升了實驗操作的價值。系統(tǒng)化的操作過程，為學(xué)生在未來參與科研課題時開拓了視野[4]。這些實驗如果都能轉(zhuǎn)化為解決某個科學(xué)問題的手段，那么學(xué)生能真正從簡單接受知識和實驗技能培訓(xùn)的被動學(xué)習(xí)，轉(zhuǎn)變?yōu)橹鲃訉ふ铱茖W(xué)問題、積極參與實驗設(shè)計的主動學(xué)習(xí)狀態(tài)，有利于激發(fā)和培養(yǎng)學(xué)生運用課堂所學(xué)，思考和解決現(xiàn)實問題的熱情和能力。

針對學(xué)科特定的科學(xué)問題，優(yōu)化實驗設(shè)計，將傳統(tǒng)單項實驗課程整合為綜合性、設(shè)計性和創(chuàng)新性實驗，或可稱為實驗教學(xué)的科研化。這種實驗教學(xué)課程科研化改革，必將為大學(xué)專業(yè)課程實驗教學(xué)帶來更多的生機(jī)和活力。