王麗霞 孟慶娟 李生龍

摘要 [目的]建立一種簡(jiǎn)便快捷且穩(wěn)定經(jīng)濟(jì)的鹽酸大觀霉素高效液相色譜檢測(cè)方法。[方法]選用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-水（35∶35∶30），檢測(cè)波長(zhǎng)415 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL的高效液相色譜條件，研究該條件下檢測(cè)樣品含量的可行性，并與國(guó)家獸藥典中的抗生素微生物檢定法（管碟法）的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。[結(jié)果]鹽酸大觀霉素濃度在100 ～900 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回收率為99.6%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.55%，穩(wěn)定性良好。同一樣品2種方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差為0.42%，符合有關(guān)規(guī)定。[結(jié)論]該試驗(yàn)使用的高效液相色譜法（HPLC）較抗生素微生物檢定法操作簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性更高。

關(guān)鍵詞 鹽酸大觀霉素;高效液相色譜法;含量測(cè)定;管碟法

中圖分類號(hào) R927.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2020）19-0198-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.052

Abstract [Objective] To establish a simple， rapid， stable and economical high performance liquid chromatography method for the detection of spectinomycin hydrochloride.[Method] C18 chromatographic column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） was selected; mobile phase： acetonitriletetrahydrofuranwater （35∶35∶30）， detection wavelength 415 nm， column temperature 30 ℃， flow rate 1 mL/min， and high performance liquid phase color 20 μL.The feasibility of measuring the sample content by this method was studied， and the results were compared with the test results of the antibiotic microorganism assay （cupplate method） in the National Veterinary Pharmacopoeia. [Result] The concentration of spectinomycin hydrochloride at 100-900 μg/mL showed a good linear relationship with the peak area， the recovery rate was 99.6%， the intra batch variation coefficient was 0.55%， and the stability was good. The relative deviation of the results of the two methods of the same sample was 0.42%， which was in conformity with the relevant regulations. [Conclusion]The high performance liquid chromatography （HPLC） used in this experiment is simpler， more accurate and more stable than the antibiotic microbiological assay.

Key words Spectinomycin hydrochloride;High performance liquid chromatography;Content determination;Cupplate method

作者簡(jiǎn)介 王麗霞（1982—），女，河北唐山人，獸醫(yī)師，碩士，從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。

收稿日期 2020-07-14

大觀霉素（spectinomycin）又稱壯觀菌素，屬于氨基糖苷類抗生素，是美國(guó)科研機(jī)構(gòu)于1960年從大觀鏈霉菌中提取得到的。由于大觀霉素對(duì)動(dòng)物體的毒副作用較小且在動(dòng)物體內(nèi)殘留甚微，因此成為獸醫(yī)及養(yǎng)殖戶用藥的首選藥物之一。大觀霉素常以鹽酸鹽或硫酸鹽的形式被使用，兩者均為白色或者類白色的粉狀物，易溶于水，極微溶于乙醇。大觀霉素分子式為C14H25ClN2O7，分子量為368.810 5 Da?？咕V較廣，可用于治療大部分革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌引起的疾病，對(duì)支原體感染也有一定的治療效果。其中，大觀霉素對(duì)淋病奈瑟菌有高度的抗菌活性，對(duì)許多腸桿菌科細(xì)菌具有中度抗菌活性，而其對(duì)沙眼衣原體和梅毒螺旋體無(wú)活性。大觀霉素是通過(guò)與細(xì)菌核糖體30S亞單位結(jié)合，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成以發(fā)揮抗菌的作用[1]。

目前獸藥典載錄的大觀霉素的主要?jiǎng)┬陀宣}酸大觀霉素注射液和鹽酸林可大觀霉素可溶性粉。鹽酸大觀霉素注射液常用于治療淋病奈瑟菌所致的前列腺炎、尿道炎、宮頸炎和直腸感染，其中治療對(duì)四環(huán)素和青霉素耐藥的菌株引起的感染效果更佳;鹽酸大觀林可霉素可溶性粉主要用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)方面，用于治療和預(yù)防鴨疫巴氏桿菌、鴨霍亂、沙門氏菌和大腸桿菌等細(xì)菌性疾病。目前，國(guó)內(nèi)畜牧業(yè)對(duì)于大觀霉素的需求量非常大，因此各科研機(jī)構(gòu)在不斷地進(jìn)行鹽酸大觀霉素臨床使用新劑型的研究，而大觀霉素的含量測(cè)定是中間必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)。大觀霉素具有極性強(qiáng)且無(wú)特征性紫外吸收基團(tuán)的特點(diǎn)，紫外最大吸收波長(zhǎng)在190 nm附近，屬于末端吸收區(qū)[2]，含量分析比較困難。目前已經(jīng)研究出的大觀霉素含量測(cè)定方法有氣相色譜法[3-4]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法[7-8]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[9-10] 、薄層色譜法[11]、高效液相色譜熒光法[12]和國(guó)家獸藥典中的抗生素微生物檢定法[13]等。其中的一些方法對(duì)儀器要求很高，缺乏特異性。在用于企業(yè)對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控時(shí)，太過(guò)耗費(fèi)成本且過(guò)程繁復(fù)。因此，極需尋找操作簡(jiǎn)便、實(shí)用經(jīng)濟(jì)且檢測(cè)效果可信度高的方法。該試驗(yàn)主要采用HPLC法對(duì)鹽酸大觀霉素含量進(jìn)行測(cè)定，HPLC法的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。而且在該試驗(yàn)中會(huì)將HPLC法的試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)家獸藥典中的抗生素微生物檢定法（管碟法）的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證HPLC法結(jié)果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物。

肺炎克雷伯標(biāo)準(zhǔn)菌種[CMCC（B）46 117]，購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;鹽酸大觀霉素原料，購(gòu)于浙江康恩貝集團(tuán)。

1.1.2 主要化學(xué)試劑。

抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)（高pH），購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)于杭州生物試劑有限公司;

磷酸二氫鉀，購(gòu)于天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;

2，4-二硝基苯肼、三氟乙酸、乙腈，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

四氫呋喃，購(gòu)于宿州化學(xué)試劑廠;

丙酮，購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;

無(wú)水葡萄糖，安徽華澳生物技術(shù)有限公司自購(gòu);

氫氧化鈉，購(gòu)于上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器。

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;

大容量電動(dòng)移液器（上海泰坦科技股份有限公司）;

電子分析天平（美國(guó)梅特勒-托利多科學(xué)儀器有限公司）;

水浴鍋（常州市華普達(dá)儀器制造廠）;

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)YX280B）;

電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;

多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，型號(hào)ZY-300IV）;

數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)KQ3200DB）;

高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 主要試劑配制

1.2.1 磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）。

稱定磷酸二氫鉀2.72 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液116.4 mL，用純水稀釋定容至400 mL。

1.2.2

細(xì)菌培養(yǎng)基。

稱定抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)（高pH）26.55 g，加熱攪拌溶解于900 mL蒸餾水中備用。

1.2.3

大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密稱定大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品37.99 mg，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）溶于25 mL容量瓶中，并稀釋至刻度線;分別移取5 mL至50 mL（S2）和100 mL（S1）容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）分別將其定容至容量瓶刻度線處。

1.2.4

鹽酸大觀霉素樣品溶液。

精密稱定鹽酸大觀霉素原料藥64.18 mg，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）溶于50 mL容量瓶中，并稀釋至刻度線;分別移取5 mL至50 mL（T2）和100 mL（T1）容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）分別將其定容至容量瓶刻度線處。

1.2.5

流動(dòng)相。

以乙腈∶四氫呋喃∶水（35∶35∶30）為流動(dòng)相，按試驗(yàn)實(shí)際需要量進(jìn)行配制。

1.2.6

衍生試劑。

稱定三氟乙酸9.12 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度線。

稱定2，4-二硝基苯肼0.50 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度線。

1.2.7

大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密稱定大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品12.50 mg于25 mL容量瓶中，用純水完全溶解，稀釋至刻度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 抗生素微生物檢定法（管碟法）

1.3.1 滅菌。

1.3.1.1

高壓滅菌。培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）、牛津杯等，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.3.1.2

高溫滅菌。陶瓷瓦片、20 mL刻度吸管在烘箱中140 ℃干熱滅菌1 h。

1.3.1.3

紫外燈滅菌。微生物室、溫度計(jì)、移液器、大容量電動(dòng)移液器、鋼管放置器等紫外燈滅菌30 min。

1.3.2 操作步驟。

①取肺炎克雷伯菌[CMCC（B）46 117]接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在37 ℃培養(yǎng)20～22 h，然后將培養(yǎng)好的菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中制備成菌液，保存?zhèn)溆谩?/p>

②將36個(gè)培養(yǎng)皿放置在工作臺(tái)上，使用刻度吸管精密量取20 mL培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃鋪平（不能有氣泡）。

③用1 mL移液器移取0.6 mL菌液于滅菌過(guò)的180 mL培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基溫度50 ℃）。

④待培養(yǎng)基冷卻凝固后，再移取5 mL含有菌液的培養(yǎng)基鋪于其上，鋪平（不能有氣泡）。

⑤將牛津杯放入鋼管放置器，待培養(yǎng)基再次冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿放置在鋼管放置器下放入牛津杯（4個(gè)）。

⑥向牛津杯中加入大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和大觀霉素樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)順序每個(gè)牛津杯加入270 μL藥液。

⑦每個(gè)樣品做一個(gè)平行，每個(gè)平行做6個(gè)重復(fù)。

⑧蓋上陶瓷瓦片，放入電熱恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃下培養(yǎng)16～18 h。

⑨培養(yǎng)好后取出放入ZY-300IV多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀進(jìn)行效價(jià)分析。

1.4 高效液相色譜法

1.4.1 色譜條件。

色譜柱為安捷倫C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈∶四氫呋喃∶水（35∶35∶30），柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)415 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2 線性關(guān)系考察。

精密稱定大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品12.50 mg于25 mL容量瓶中，用純水完全溶解，稀釋至刻度。分別準(zhǔn)確量取1、3、5、7、9 mL標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用純水稀釋至刻度，搖勻;各吸取0.5 mL于5 mL離心管中，分別加入2 mL三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液和2 mL 2，4-二硝基苯肼（DNPH）-乙腈溶液，將其置于旋渦振蕩器上充分振蕩，然后置于恒溫水浴鍋中于70 ℃下進(jìn)行衍生化反應(yīng)60 min，衍生化反應(yīng)結(jié)束后放置于冰水中，待冷卻后加入丙酮0.5 mL以終止反應(yīng)，再次充分振蕩，繼續(xù)置于恒溫水浴鍋中于70 ℃下加熱10 min，取出后在室溫下自然冷卻，于11 000 r/min離心10 min，過(guò)膜后利用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，以大觀霉素色譜峰面積與相應(yīng)的藥物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程。

1.4.3 回收率試驗(yàn)。

以無(wú)水葡萄糖為空白輔料，分別向其中加入大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品，制成標(biāo)示量80%、100%、120% 3個(gè)已知濃度樣品，按照“1.4.2”項(xiàng)下衍生方法對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行處理，利用HPLC對(duì)其進(jìn)行含量檢測(cè)，代入以下公式計(jì)算每個(gè)樣品的回收率，即回收率=實(shí)際百分含量/理論百分含量×100%。

1.4.4 精密度試驗(yàn)。

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備液的方法配制100、500和900 μg/mL 3種不同濃度的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各3份，按照“1.4.2”項(xiàng)下衍生方法對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行處理，利用HPLC對(duì)其進(jìn)行含量檢測(cè)，每個(gè)樣品連續(xù)檢測(cè)3次，將試驗(yàn)結(jié)果代入以下公式并計(jì)算3組樣品的批內(nèi)變異系數(shù)，變異系數(shù)=（標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值）×100%。

1.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備液的方法配制300 μg/mL的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“1.4.2”項(xiàng)下衍生方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，過(guò)膜后利用HPLC對(duì)分別放置0、3、6 h的樣品溶液進(jìn)行含量檢測(cè)，以峰面積計(jì)算大觀霉素的RSD。

1.4.6 雜質(zhì)干擾試驗(yàn)。

取空白原料藥（僅含輔料無(wú)水葡萄糖），按照“1.4.2”項(xiàng)下衍生方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，過(guò)膜后利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，觀察在對(duì)照品出峰的相應(yīng)時(shí)間內(nèi)空白輔料有無(wú)峰面積。

1.4.7 含量測(cè)定。

精密稱定鹽酸大觀霉素原料12.50 mg于25 mL容量瓶中，用純水完全溶解，稀釋至刻度。分別準(zhǔn)確移取0.5 mL待測(cè)大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和鹽酸大觀霉素樣品溶液于5 mL離心管中，再分別加入2 mL三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液和2 mL 2，4-二硝基苯肼（DNPH）-乙腈溶液，將離心管置于旋渦振蕩器上充分振蕩，然后放置在70 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行衍生化反應(yīng)60 min，結(jié)束后放置于冰水中，待其冷卻后加入丙酮0.5 mL以終止反應(yīng)，充分振蕩，再置于70 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min，取出后在室溫下自然冷卻，然后11 000 r/min離心10 min，過(guò)膜后利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素微生物檢定法（管碟法）檢測(cè)

抗生素微生物檢定法的檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表1，其中所使用的標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)為644.0 IU/mg。使用ZY-300IV多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀讀數(shù)分析后，可知該鹽酸大觀霉素原料藥的效價(jià)為668.5 IU/mg，其中平均可信限率FL=4.243 1%，偏離平行F3=3.842 6，P>0.05。同法平行試驗(yàn)測(cè)得結(jié)果為該鹽酸大觀霉素原料藥的效價(jià)為672.7 IU/mg，其中平均可信限率FL=4.692 3%，偏離平行F3=1.840 8，P>0.05。

根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2015年版第一部）要求，平均可信限率不得大于5%，偏離平行F3不得大于5，P應(yīng)大于0.05。由表1可知，結(jié)果均符合規(guī)定，平均效價(jià)為670.6 IU/mg。

2.2 高效液相色譜檢測(cè)

2.2.1 線性關(guān)系考察。

將配制的5個(gè)不同濃度的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，鹽酸大觀霉素濃度在100～900 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=9.376 1x+122.15（R2=0.999 7）。

2.2.2 回收率試驗(yàn)。

由表2可知，所配制的80%、100%和120% 3個(gè)已知濃度樣品的回收率分別是79.2%、99.0%、120.8%，經(jīng)過(guò)計(jì)算可知其平均回收率為99.7%，表明該試驗(yàn)大觀霉素檢測(cè)方法的回收率良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn)。由表3可知，100、500和900 μg/mL 3組不同濃度大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.12%、0.42%和0.10%，平均批內(nèi)變異系數(shù)為0.55%，表明該試驗(yàn)的大觀霉素檢測(cè)方法精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。由表4可知，在放置0、3和6 h檢測(cè)的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液以峰面積計(jì)算的RSD分別為0.33%、0.17%和0.21%，表明該試驗(yàn)方法所處理的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在6 h內(nèi)檢測(cè)含量穩(wěn)定。

2.2.5 雜質(zhì)干擾試驗(yàn)。

利用高效液相色譜檢測(cè)的鹽酸大觀霉素空白、大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液與鹽酸大觀霉素供試品溶液的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2～4。

通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的出峰時(shí)間可知，供試品出峰時(shí)間和對(duì)照品出峰時(shí)間一致，由此定性說(shuō)明此供試品是大觀霉素;通過(guò)觀察供試品和輔料空白圖譜可知，在供試品出峰時(shí)間內(nèi)，空白輔料未檢測(cè)出峰面積，說(shuō)明輔料對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。

2.2.6 含量測(cè)定。

鹽酸大觀霉素原料藥經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)分析后得其含量結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，測(cè)量的3個(gè)平行樣品的檢測(cè)效價(jià)結(jié)果分別為676.8、676.0和676.2 IU/mg，其平均效價(jià)值為676.3 IU/mg，后經(jīng)自動(dòng)水分滴定儀檢測(cè)該原料藥的水分為16.3%，其含量按干燥品計(jì)算結(jié)果為808.0 IU/mg，而2015版獸藥典第一部規(guī)定鹽酸大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)含量應(yīng)大于779.0 IU/mg，由此可見(jiàn)該原料符合獸藥典規(guī)定，判定該批原料合格。

3 討論

3.1 管碟法的優(yōu)缺點(diǎn)

抗生素微生物檢定法（管碟法）是我國(guó)獸藥典中鹽酸大觀霉素含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法主要是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基中的擴(kuò)散作用，來(lái)比較標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液二者對(duì)接種的試驗(yàn)菌種的抑制作用，即表現(xiàn)在瓊脂培養(yǎng)基上抑菌圈的大小，以此來(lái)測(cè)定供試品的效價(jià)。管碟法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是也有明顯的不足：①整個(gè)操作過(guò)程繁瑣復(fù)雜，工作量大，測(cè)定周期長(zhǎng)，且需要精確熟練的操作。②對(duì)于操作空間要求較高，操作前需要對(duì)微生物室、操作臺(tái)、試驗(yàn)使用的器材設(shè)備等進(jìn)行滅菌，確保試驗(yàn)過(guò)程不被其他雜菌污染。③肺炎克雷伯氏菌是條件致病菌，試驗(yàn)安全性低，且菌種的保存要求高，需傳代培養(yǎng)，制備的菌液容易在操作過(guò)程中被雜菌污染，需現(xiàn)配現(xiàn)用。④該方法測(cè)定的是總效價(jià)，無(wú)法區(qū)別主要成分和其他相關(guān)組分的含量，也不能確定雜質(zhì)的有關(guān)信息，因此不能直觀地反映鹽酸大觀霉素的純度[2]。

3.2 高效液相色譜檢測(cè)法條件的選擇

由于大觀霉素沒(méi)有特征性紫外吸收光譜，所以該試驗(yàn)采用了衍生化法。利用大觀霉素結(jié)構(gòu)中的活潑基團(tuán)與衍生試劑形成在紫外區(qū)有吸收的基團(tuán)，以便于紫外檢測(cè)[1]。

該試驗(yàn)選擇了乙腈-四氫呋喃-水（35∶35∶30）為流動(dòng)相，此流動(dòng)相比例能縮短出峰時(shí)間，并且雜峰分離清晰，互不干擾，便于鹽酸大觀霉素含量的檢測(cè)。

3.3 衍生試劑的選擇

該試驗(yàn)選用了三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液和2，4-二硝基苯肼（DNPH）-乙腈溶液為衍生試劑，2，4-二硝基苯肼（DNPH）可與大觀霉素的羰基反應(yīng)生成苯腙化合物2，4-二硝基苯肼（DNPH）-大觀霉素[14]，反應(yīng)需在酸性條件下進(jìn)行，三氟乙酸（TFA）即用于控制反應(yīng)過(guò)程中的酸性條件[15]。文獻(xiàn)報(bào)道，三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液的濃度有3%[16]和6%[14]，使用這2種濃度的三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液發(fā)現(xiàn)，經(jīng)其處理后的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和鹽酸大觀霉素供試品溶液降解速度快，不利于檢測(cè)。而提高三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液的濃度為9%[17]后，大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和鹽酸大觀霉素供試品溶液不容易降解，并且穩(wěn)定性至少可以維持6 h。

3.4 注意事項(xiàng)

抗生素微生物檢定法（管碟法）中應(yīng)注意菌種菌液的保存及試驗(yàn)器材的滅菌，而且要將高壓滅菌的器材放入烘箱中烘干，不能殘留水分;鋪培養(yǎng)皿時(shí)要邊鋪邊搖晃，使得瓊脂培養(yǎng)基鋪平、鋪滿且不能有氣泡;向培養(yǎng)基中加菌液時(shí)，要求培養(yǎng)基的溫度在50 ℃左右，以確保細(xì)菌的活性;使用移液器向牛津杯中注入大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和鹽酸大觀霉素供試品溶液時(shí)要注意掌握力度，緩慢注入，且每個(gè)牛津杯注入的量要保持一致，不能濺到牛津杯外。

高效液相色譜檢測(cè)法中，大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和鹽酸大觀霉素樣品溶液要同時(shí)配制同時(shí)衍生，配制完成標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液應(yīng)放在避光處保存。

4 結(jié)論

該研究分別采用HPLC法和抗生素微生物檢定法（管碟法）對(duì)鹽酸大觀霉素含量進(jìn)行測(cè)定，2種方法測(cè)得結(jié)果基本一致。HPLC法測(cè)得鹽酸大觀霉素濃度在100～900 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，同時(shí)具有良好的回收率、精密度及穩(wěn)定性，且該方法檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高，比管碟法更適用于企業(yè)對(duì)鹽酸大觀霉素原料及相關(guān)半成品和成品的質(zhì)量監(jiān)控。

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